1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
白细胞介素（Interleukin, IL）是一类重要的具有免疫生物学功能的细胞因子，目前已发现了35种白细胞介素，参与机体的免疫调节、造血、炎症反应等过程。白细胞介素17(Interleukin-17, IL-17)是其中重要的成员之一。IL-17家族有4个保守的半胱氨酸,对蛋白三级结构的保持具有重要作用[1]。目前，对哺乳类白细胞介素17的研究比较广泛和深入，至今共发现了6个家族成员（IL-17A~IL-17F），主要由辅助性T细胞TH17分泌，在抵抗胞外细菌、真菌感染的宿主防御以及各种自身免疫性疾病发病中起到了重要的作用[2]，应用前景十分广阔。
IL-17基因家族非常古老，不仅存在于哺乳动物中，仍存在于鱼类和一些无脊椎动物中，但目前国内外对白细胞介素17在低等脊椎动物中的研究仍较少。鱼类作为进化上连结低等无脊椎动物和高等脊椎动物的重要环节，具有特殊的进化地位，因此，开展对鱼类IL-17N的研究，不仅可以填补低等脊椎动物免疫学研究的不足和空白，丰富鱼类免疫学的内容，为鱼类病害防治提供基础资料，而且对脊椎和无脊椎动物比较免疫学以及免疫因子分子进化研究具有重要的意义[3]。至今在一些鱼类如斑马鱼[4]、鲑鳟鱼类[5-8]、青鱂和河豚[5,9]等鱼类中已克隆到了IL-17A/F1-3, IL-17B, IL-17C, IL-17D, 由于鱼类进化过程中染色体加倍，出现了两个IL-17C，系统分析表明鱼类IL-17C与哺乳动物的IL-17C和IL-17E关系较密切[6]。此外，在鱼体中还分离到鱼类特有的IL-17的配体IL-17N。由于鱼类IL-17N只在少数几种鱼中被克隆，因此有关IL-17N的系统发育研究结果还不确定[9,10]，而IL-17N的功能研究也比较缺乏。鉴于IL-17在动物免疫、炎症中的重要作用，有必要对鱼类IL-17N系统发育进行比较可靠的分析，对其表达模式进行相关研究，以及其信号通路、功能等进行研究，以完善对IL-17N的认识。
鲤鱼是我国重要的经济淡水鱼类之一，且作为低等脊椎动物中硬骨鱼类的代表物种，对其IL-17N基因进行克隆、表达并得到有生物学活性的原核表达蛋白可为进一步阐明鱼类IL-17N基因的性质与功能打下基础。本实验以鲤鱼为研究对象，通过线性分析和BLAST同源比对，获得鲤鱼IL-17N序列，完善了斑马鱼IL-17N序列，比较全面地对IL-17N的系统发育进行了分析，揭示了鲤鱼IL-17N的组织表达和嗜水气单胞菌感染后的表达特征，构建了IL-17N及IL-17受体A的原核表达质粒，优化了原核表达的条件，得到了具有生物学活性的鲤鱼IL-17N蛋白，为今后研究IL-17N的蛋白功能及信号通路奠定了基础，使人们对鱼类IL-17N有更加清晰的认识。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标: 揭示鲤鱼的IL-17N基因的结构、系统发育，表达模式，获得鲤鱼IL-17N和IL-17RA原核表达蛋白。
研究的主要内容：
1、克隆鲤鱼的IL-17N基因，构建原核表达载体，并优化蛋白表达条件；
3. 研究的方法与方案
研究方法：运用BLAST、线性分析获得IL17N序列，使用RT-PCR克隆鲤鱼IL-17N基因；运用定量RT-PCR测定IL-17N在不同组织中的表达情况；构建原核表达质粒，诱导并纯化可溶蛋白；运用BCA法测定蛋白浓度。
技术路线：使用BLAST和线性分析，在鲤鱼基因组中获得鲤鱼IL-17N序列，使用RT-PCR获得了cDNA，揭示鲤鱼IL-17N的基因结构，分析了IL-17N的系统发育；使用定量RT-PCR测定了IL-17N在不同组织中的表达情况；成功得到IL-17N基因克隆后，构建了IL-17N和IL-17受体A的重组原核表达质粒，诱导并纯化了蛋白，为今后进一步分析IL-17N和IL-17RA的亲和力奠定基础，以便从基因功能和作用通路等方面对IL-17N有更加清晰的认识。
可行性分析：鲤鱼、草鱼等基因组序列均已在相关的网站上能获得，河豚等鱼类IL-17N基因序列能找到，因此获得鲤鱼、草鱼IL-17N序列并不困难。经过预实验，可检测到IL-17N在原核细胞中成功表达并且蛋白大小正确，因此可进行大量基因克隆与诱导表达实验。
4. 研究创新点
IL-17N基因是最新发现的，为鱼类所特有的白细胞介素。目前在鱼类中的研究仍较少，只在少数几种鱼类中获得了IL-17N序列，且对其与其他IL-17家族成员的关系，其在IL-17N家族中的地位仍无法确定，有的认为属于IL-17A/F亚家族，但存在争议。鲤鱼为我国广泛养殖的淡水经济型鱼类，具有较高的营养价值和经济价值，但目前为止，对于IL-17N基因在鲤鱼中的研究仍无任何报道。
本实验构建了鲤鱼IL-17N基因和IL-17受体A的重组原核表达质粒，诱导并纯化了蛋白，为今后进一步分析IL-17N和IL-17RA的亲和力奠定了基础，最终可通过其基因功能的进一步研究和作用通路的确定来判断IL-17N基因是否属于IL-17A/F亚家族。
因此开展鲤鱼IL-17N基因的起源、进化规律及其功能的研究，进一步为进一步探索出IL-17N基因在鱼体中发挥的生物学作用打下基础，最终将科研成果转化为产品用于生产实践活动，如用于鱼类免疫生物制剂的制备，促进鱼体的健康，增加鱼类养殖的安全性、生态性，提高养殖效益。
5. 研究计划与进展
研究计划：
1.2016年5月-2016年7月：课题的选定与实验准备阶段
（1）查阅大量文献并综合分析国内外鱼类IL-17N的研究进展，最终确定课题
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