1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
刀鲚(Coilia ectenes)，又称长颌鲚，俗称刀鱼，隶属鲱形目(Clupeiformes)，鲱科(Clupeidae)，鲚属(Coilia)。我国长江中下游地区分布的的刀鲚最早是Jorden和Seale于1905年根据上海标本命名的一个物种。刀鲚是一种溯河洄游性鱼类，平时生活在中国、日本和朝鲜沿海，春季性成熟后从河口溯江而上进入江、湖中产卵繁殖，孵化后的幼鱼再返海肥育。约每年的2月中旬开始，亲鱼由海入江进行生殖洄游。长江刀鲚资源调查协作组的调查指出，长江刀鲚的渔获量自1973年达最高值后开始下降，且种群的年龄、体长、体重等都有趋低的现象。长江刀鲚雄性生殖生物学的研究仅仅局限于生殖系统的结构和精子的超微结构等方面的研究。因此，深入研究长江刀鲚精子发生的分子机制，已经成为其生殖生物学研究的一个热点问题。 热休克蛋白 (Heat shock proteins, HSPs)是一类最广泛存在且高度保守的多基因超家族，由于它们具有蛋白伴侣功能 (Hartl, 1996; Gething and Sambrook, 1992; Mayer and Bukau, 2005; Gusev et al, 2005)，参与发育调控机制 (Giudice et al, 1999; Christians et al, 2003)以及参与抗化学、物理和病理等的分子耐受机制调控 (Lindquist and Craig, 1988; Macario and Conway de Macario, 2007)而受到广泛的关注。根据这些多基因超家族成员编码氨基酸的相对分子量将他们分为：HSP 100，HSP 90，HSP 70，HSP 60和小HSPs (Christians et al, 2003)等亚家族。在这些不同亚家族的热激蛋白中，HSP70是保守性最高，而且也是在真核生物中研究最为深入的一类 (Papadimitrou et al, 1998; Neuer et al, 2000)。研究发现，一些HSP70在精巢和精子中高度表达，而HSP70-2则是最先在老鼠的精巢中被鉴定出来的一种精巢特异表达的基因(Allen et al, 1996; Feng et al, 2001)，该基因参与了雄性老鼠生殖细胞的调控 (Eddy, 1999)。 精子发生是一个界限分明的，精确同步且时空合理的生物学过程，这种时空进程为生殖细胞分化过程中基因的调控机制研究提供了良好的生物学模型。精子发生过程包括精原细胞的增殖、精母细胞的成熟分裂和精子细胞变态为精子三个主要过程，而上述三个阶段的生殖细胞又被分别称为精原细胞、精母细胞和精子细胞 (Angelier et al, 1996; Eddy, 1999)。在上述复杂的变化过程中，热休克蛋白参与了相关的调控过程 ( Isobe and Yoshimura, 2007)。 在老鼠、兔子和人类的研究中已经发现，HSP70的不同异构体在精子发生的过程中具有时期特异性和发育相关性 (Mori et al, 1997; Chan et al, 2003; Angelier et al, 1996) ，对生殖细胞的分化具有重要的调控作用(Allen et al, 1996; Krone et al, 2003)。基因打靶实验证实，中断老鼠HSP70-2基因的表达可以导致生殖细胞减数分裂停止，生殖细胞凋亡和雄性的不育症 (Feng et al, 2001; Matwee et al, 2001)。此外，研究还证实HSP70还在人类、兔子、牛和其他一些水生生物的精子发生、受精和胚胎发育等过程中具有不可或缺的作用 (Neuer et al, 2000; Matwee et al, 2001; Choresh et al., 2004; Evans et al, 2005; Heikkila, 2010)。更为重要的是，近年来一些热激蛋白基因和HSP70家族已经在两栖类Xenopus laevis (Ali et al., 1996; Lang et al, 2000)，Pleurodeles waltl (Delelis-Fanien et al, 1997)和Ambystoma mexicanum (Lvesque et al, 2005)中鉴定出来，并证实HSP70蛋白家族参与了精子发生过程，卵子的发生，胚胎发育和细胞抗胁迫的应激过程。然而关于HSP70在长江刀鲚精子发生过程的作用机制还没有相关研究报道。因此，深入研究长江刀鲚精子发生的分子机制，已经成为雄性长江刀鲚生殖生物学研究迫在眉睫的热点问题。 主要参考文献 张敏莹，徐东坡，刘凯，等．长江下游刀鲚生物学及最大持续产量研究［J］．长江流域资源与环境，2005, 14(6):694-698 . 陈文银，李家乐，练青平．长江刀鲚性腺发育的组织学研究[J].水产学报，2006,30(6):773-777. 南京大学生物系鱼类科研组，湖北省长江水产研究所，江苏省水产科学研究所．刀鲚性腺解剖和分期的初步研究 [R]．武汉：长江流域刀鲚资源协作组，1977:165-179. 何为，李家乐，江芝娟．长江刀鲚性腺的细胞学观察[J]. 上海水产大学学报，2006, 15(3): 292-296. 王冰，万全，李飞，等．刀鲚精子超微结构研究[J]．水生态学杂志，2010,3(3):57-62. Allen, J.W, Dix, D.J, Collins, B.W, Merrick, B.A, He, C, Selkirk, J.K, Poorman-Allen, P, Dresser, M.E, Eddy, E.M, 1996. HSP70-2 is part of the synaptonemal complex in mouse and hamster spermatocytes. Chromosoma 104 (6), 414-421. Boorstein, W.R, Ziegelhoffer, T, Craig, E.A, 1994. Molecular evolution of the HSP70 multigene family. J. Mol. Evol. 38, 117. Christians, E.S, Zhou, Q, Renard. J, Benjamin, I.J, 2003. Heat shock proteins in mammalian development. Semin Cell Dev. Biol. 14, 283290. Eddy, E.M, 1999. Role of heat shock protein HSP70-2 in spermatogenesis Rev Reprod 4, 2330. Evans, T.G, Yamamoto, Y, Jeffery, W.R, Krone, P.H, 2005. Zebrafish Hsp70 is required for embryonic formation. Cell Stress Chaperones 10, 6678. Gething, M.J, Sambrook, J, 1992. Protein folding in the cell. Nature 335, 3345. Gupta, R.S, Singh, B, 1994. Phylogenetic analysis of 70 kDa heat shock protein sequences suggests a chimeric origin for the eukaryotic cell nucleus Curr Biol 4, 11041114. Helmbrecht, K, Zeise, E, Rensing, L, 2000. Chaperones in cell cycle regulation and mitogenic signal transduction, a review. Cell Prolif. 33, 341365. Kamaruddin, M, Kroetsch, T, Basrur, P.K, Hansen, P.J, King, W.A, 2004. Immunolocalization of heat shock protein 70 in bovine spermatozoa. Andrologia 36 (5), 327-34. Kiang, J.G., Tsokos, G.C, 1998. Heat shock protein 70 kDa, molecular biology, biochemistry, and physiology. Pharmacol Ther. 80, 183201. Knowlton, A.A, Salfity, M, 1996. Nuclear localization and the heat shock proteins. J. Biosci. 21, 123132. Krone. P.H, Evans, T.G, Blechinger, S.R, 2003. Heat shock gene expression and function during zebrafish embryogenesis. Semin. Cell Dev. Biol. 14, 267274. Lindquist, S, Craig, E.A, 1988. The heat shock proteins. Ann. Rev. Genet 22, 631677. Mayer, M.P, Bukau, B, 2005. Hsp70 chaperones, cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol. Life Sci. 62, 670684. Multhoff, G, 2007. Heat shock protein 70 (Hsp70), membrane location, export and immunological relevance. Methods 43, 229237. Neuer, A, Spandorfer, S.D., Giraldo, P, Dieterle, S, Rosenwaks, Z, Witkin, S.S, 2000. The role of heat shock proteins in reproduction. Hum. Reprod. Update 6, 149159.
2. 研究的基本内容和问题
研究目标： 1、研究长江刀鲚HSP70的基因结构特征 2、研究长江刀鲚HSP70 cDNA所编码蛋白的结构特征 3、探讨长江刀鲚HSP70在精巢发育各期的作用 4、探讨HSP70在长江刀鲚精子发生中的作用
研究内容： 1、克隆长江刀鲚HSP70基因的cDNA片段 2、利用RACE技术获得HSP70的基因全长 3、分析长江刀鲚HSP70的组织表达特征 4、分析长江刀鲚HSP70精巢发育各期的时空表达特征 5、研究HSP70蛋白在长江刀鲚精巢的定位
拟解决的关键问题： 1、长江刀鲚是江海洄游生殖型鱼类，本研究拟通过分子生物学手段结合 免疫组织化学技术探讨长江刀鲚洄游生殖期间精巢发生各期HSP70表达量的实时变化，初步阐释长江刀鲚HSP70在精巢发育各期的作用。 2、精子发生是一系列的程序化过程，其相关蛋白在精子发生过程中具有决定性的作用，HSP70是一种精子发生密切相关蛋白，本研究拟通过IHC技术，对长江刀鲚精巢HSP70进行定位研究，探讨HSP70在长江刀鲚精子发生中的作用，为后续长江刀鲚的生殖生物学研究提供参考资料。
3. 研究的方法与方案
1、研究方法 本研究以长江刀鲚为研究对象，采用分子生物学和免疫组织化学的相关技术和方法，初步研究长江刀鲚精子发生的基因调控机制 。
2、技术路线 采取不同阶段的刀鲚精巢分别作以下处理： 克隆HSP70基因及其全长系列； RT-PCR技术检测HSP70的组织分布； IHC技术检测HSP70蛋白在精巢的定位； 3、实验手段 本实验主要采用常规的采样手段，结合分子生物学技术和免疫组织化学技术，对长江刀鲚的精巢发生和精子发生规律进行研究。
4、关键技术 本研究的关键技术包括分子生物学技术和免疫组织化学技术。
4. 研究创新点
1、本研究针对洄游生殖型鱼类生殖生物学中雄性生殖极其薄弱的现状，以长江刀鱼雄性生殖研究为突破口，以期解决多年来为长江刀鲚的人工繁育问题和资源衰减问题以及今后的分子遗传辅助育种提供理论参考。
2、本研究利用分子生物学技术结合免疫组织化学的方法，联合NCBI数据库的资料对长江刀鲚的HSP70的分子生物学特征进行研究，这一研究是长江刀鲚精子发生分子机制的首次研究，本研究如获成功将对长江刀鲚的分子生物学研究具有重大的借鉴意义。
5. 研究计划与进展
(1) 2013.06-2013.07 采样，查阅资料，试拟定试验方案。
(2) 2013.08-2013.12 实验，进行试验数据的整理、分析。
(3) 2014.01-2014.4 撰写开题报告、毕业论文。
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