1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
目前，尽管胚胎体外发育到囊胚然后再进行胚胎移植这种技术的效率已经有了很大的提高，不过由这种技术产生的新生胎儿仍旧存在很多的问题，比如，早期胚胎或胎儿死亡[1,2]，胎儿异常，高出生重，胎盘变形[3,4]等。现在评价胚胎发育潜力的方式大致可以两种，一种是评价囊胚质量，另一种就是根据胚胎在受体中的发育参数来评价。但这两种方法都不够精细，并且很昂贵，所以我们需要一种更加精确并且实用的方式来评价胚胎的质量，从而对胚胎的健康发育提供更好的保证。建立猪囊胚孵化后体外培养体系可以对支持更高级的发育提供很大的帮助，通过比较胚胎在这个程序中的发育潜力，可以对各种培养和操作胚胎的系统价值进行一个评价，也是一种具有很高预测价值的系统。有助于推进各种方法最优化的进程，这将会为研究胚胎发育机制提供一种新的可能。
早期，虽然科学家尝试体外培养小鼠和大鼠囊胚后胚胎，并体外发育几天到外胚层分化期，但大部分胚胎都凋亡并只有个别细胞能够发育[5,6],而最成功的则要归功于丹麦Vajta所带领的团队，把牛的孵化后囊胚成功体外培养到16天，并对该时期胚胎的形态及滋养层与内细胞团细胞的分化进行了初步观测分析[7，8，9]。本实验将会结合丹麦Vajta团队在牛胚胎孵化后体外培养系统成功建立的基础上，探索猪胚胎孵化后体外培养系统，并进一步分析在这期间不同时期胚胎的转录、表观、及分化机制。
1. Hill JR, Burghardt RC, Jones K, Long CR, Looney CR, Shin T, Spencer TE, Thompson JA, Winger QA, Westhusin ME. Evidence for placental abnormality as the major cause of mortality in first-trimester
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：建立猪胚胎孵化后体外的培养体系，在这个体系中胚胎能够形成内胚层，实现初步的分化，并对这个过程中胚胎的发育机制进行深入研究。
研究内容：首先卵母细胞收集，体外成熟培养，并进行孤雌激活，生产囊胚。之后，基于前人研究基础建立并优化猪孵化后囊胚的体外培养体系，并检测胚胎发育，通过改善体系培养条件调控其分化，从而更深入的了解猪胚胎干细胞的及猪胚胎在子宫内漂浮时期的发育特点。
关键问题：猪胚胎的后期发育一直是我们实验中最难的部分，也是猪胚胎体外孵化体系迟迟不能解决的主要原因。葡萄糖对胚胎的整个发育过程都有促进作用，同时在胎牛血清中有很多未知生长因子，所以，在整个培养系统中会加入葡糖糖和胎牛血清来促进胚胎发育。胚胎在孵化后发育会有一个延伸（elongation）的过程，如果在正常的培养条件下，胚胎很难延伸，而我们将采取在琼脂糖凝胶中打孔来模拟输卵管的形式，提供胚胎延伸的条件。
3. 研究的方法与方案
①卵母细胞来源南京市固定的屠宰场收集卵巢，收集并挑选卵母细胞在实验室进行42小时的体外成熟
②孤雌激活技术，生产猪的胚胎并体外培养发育到囊胚，在体外培养的第7天收集孵化囊胚或无透明带囊胚
③制作凝胶人工培养系统：首先凝胶的准备：把高浓度的凝胶（A-4718）在含有钙离子和镁离子的PBS溶液中稀释成3%浓度的凝胶；梳子的准备：把自做的玻璃管（12-14毫米）一头封闭，另一头黏按照1.5-2毫米的距离黏于一个玻璃片上，构成制作凝胶孔的梳子。利用该梳子结合凝胶凝固，制作大小为12-14长，宽1毫米作用的培养孔（斜孔），并加入胚胎培养液平衡冲洗三次共计三天，使最终平衡冲洗液的渗透压不高于290mOsm。在囊胚最终放入培养前，用新的胚胎培养液（含有不同的蛋白添加）代替平衡冲洗液，并把该培养盘放在38.5℃，含有5%二氧化碳的培养箱中过夜。
4. 研究创新点
本实验首次对猪胚胎发育到囊胚后，然后对囊胚的质量进行评价，筛选出表形好的囊胚，将囊胚放入斜的琼脂糖凝胶孔中培养，待囊胚在孔中发育，由于猪胚胎在发育中从在很多未知因子，猪胚胎的死亡率往往很高，因此在前人在牛囊胚培养液中加入了葡萄糖和牛血清并将牛囊胚培养到第16天的基础上，我们会尝试在培养液中加入白血病抑制因子（LIF），这是一种子宫内膜分泌的糖蛋白，有研究表明，它在胚胎的附植、生长、发育和分化等方面具有重要的作用。LIF表达的主要部位主要是子宫内膜腺上皮细胞，它在妊娠早期起着启动胚泡附植和促进胚胎发育的作用。我们的思路认为，胚胎的发育是一个胚体和子宫的共同作用的结果，胚胎体外发育之所以不成功是因为胚胎缺少了子宫对它的作用，我们尝试着将子宫在妊娠时产生的某些因子添加入培养基，来探索胚胎的体外发育体系。
5. 研究计划与进展
2月28日-3月10日 | 学习卵母细胞体外培养，孤雌激活技术 |
3月10日-3月24日 | 阅读了相关文献，并探索了制胶打孔 |
3月24日-4月15日 | 囊胚的体外培养系统建立，对于培养液进行调整，同时深入阅读相关文献 |
4月15日-5月1日 | 固定制作切片，数据分析，讨论 |
5月1日-5月15日 | 写毕业设计文章，准备答辩 |
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