1. 研究目的与意义
丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根茎，主产于安徽、河南、陕西等地。丹参性微寒，味苦。具有活血祛瘀、通经止痛，清心除烦、凉血消痈等功效。丹参茎叶中含有丰富的丹参酚酸类成分，其含量与丹参根茎相当，本课题主要研究丹参茎叶中的活性物质对糖尿病小鼠的肠屏障和肠道微生物的作用。
通过回流提取分别获得丹参茎叶水提物以及不同浓度醇提物，以高糖和AGEs损伤的大鼠小肠隐窝上皮细胞（IEC-6）模拟体外糖尿病肠病模型，对丹参茎叶水提物以及醇提物的保护作用进行筛选。同时，链脲佐菌素建立糖尿病肠病小鼠模型，对体外筛选结果进行验证，通过血清检测血管活性肠肽VIP、肠道病理、肠道菌群等指标进一步验证丹参茎叶对糖尿病小鼠的肠屏障和肠道微生物的作用。
本课题通过体内外模型研究丹参茎叶对糖尿病肠病的保护作用及其机制，首次对丹参茎叶防治糖尿病肠病资源价值进探讨，为丹参茎叶的资源价值开发和利用提供新的方向。
2. 文献综述
丹参化学成分及其药理作用研究进展
摘 要：目的：概述国内外近年来有关丹参的化学成分及药理作用研究进展情况。方法：综合分析多年来有关文献资料，总结丹参的化学成分和现代药理作用。结果：丹参主要分为水溶性酚酸类成分和脂溶性二萜醌类成分。丹参被认为有广泛的药理作用，对心血管系统、消化系统、中枢神经系统、抗凝血、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等方面均能发挥作用。结论：丹参化学成分的研究日渐完善，对其药理作用的研究应用也日渐充实，丹参的药理作用广泛，疗效肯定，值得临床研究和推广。
关键词：丹参；化学成分；药理作用
丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根茎。主产于安徽、河南、陕西等地。丹参性微寒，味苦。具有活血祛瘀、通经止痛，清心除烦、凉血消痈等功效，用于胸痹心痛、脘腹肋痛、癥瘕积聚、热痹疼痛、心烦不眠、月经不调、痛经闭经、疮疡肿痛等。
1. 丹参的化学成分
丹参药理活性的物质基础研究早在20世纪30年代就开始了，最初从丹参根部分离出了丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB等主要成分。40年代，我国王序等证明了丹参酮Ⅰ的结构为二萜醌类四环化合物，70年代，我国药物研究机构对丹参脂溶性成分和水溶性成分的化学结构和药理活性进行了大量的研究工作[1-2]。近年来，随着新技术新方法的广泛应用以及化合物分离鉴定技术水平的提高，丹参中越来越多的化学成分得到确定，其中部分化学成分已进行了药理学活性研究。目前，从丹参中分离的化学成分达100 多种[3]，有效成分主要分为水溶性酚酸类成分和脂溶性二萜醌类成分，同时还含有含量较丰富的黄酮、三萜以及生物大分子等成分。
1.1水溶性酚酸类成分
水溶性酚酸类化合物具有苯酚和羧酸结构， 其水溶性较强， 目前已从丹参中发现酚酸类化合物24个，主要包括：丹参素（Danshensu）、咖啡酸（Caffeic acid）、丹参酸甲（Salianic acid A）、丹参酸乙（Salianic acid B）、丹参酸丙（Salianic acid C）、丹酚酸A、B、C、D、E、F、G（Salvianolic acid A、B、C、D、E、F、G）、异阿魏酸（Isoferulic acid）、迷迭香酸（Rosmarinic acid）、紫草酸（Lithospermic acid）等[4]。其中最早发现的是丹参素，之后发现了一系列酚酸类化合物，分别命名为丹酚酸 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J等。丹酚酸B是丹参中酚性酸的主要成分 [1,5,6]，丹酚酸A和丹酚酸B的生物活性研究得较为深入，已成为丹参临床用药的质量控制成分，是丹参临床应用中重要生物活性物质[7]。丹参中酚酸类化合物的结构主要为丹参素与一个或多个咖啡酸的缩合物，或丹参素的衍生物，或迷迭香酸衍生物[8]。
表1 水溶性丹参酚酸类化合物
NO. | 化合物 | Formula | Structure |
1 | 丹参素 Danshensu | C9H10O5 | |
2 | 咖啡酸 Caffeic acid | C9H8O4 | |
3 | 丹参酸C Salvianic acid C | C18H18O9 | |
4 | 丹酚酸A Salvianolic acid A | C26H22O10 | |
5 | 丹酚酸B Salvianolic acid B | C36H30O16 | |
6 | 迷迭香酸 Rosmarinic acid | C18H16O8 | |
7 | 紫草酸 Lithospermic acid | C27H22O12 | |
8 | 原儿茶酸 Protocatechuic acid | C7H6O3 | |
9 | 原儿茶醛Protocatechuic aldehyde | C7H6O4 |
1.2脂溶性二萜醌类成分
目前已从丹参中发现二萜醌类化合物43个，根据其化合物结构骨架可分为两类，即邻醌型的丹参酮类(tanshinone)和对醌型的罗列酮类(royleanone)，主要有丹参酮Ⅰ(tanshinone I, TSI)、丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA, TSA)、丹参酮ⅡB(tanshinone B, TSB)、隐丹参酮(cryptotanshinone, CTS)、异隐丹参酮(isocryptotanshinone)、15,16-二氢丹参酮(15,16-dihydrotanshinone, DTS)，羟基丹参酮(hydroxytanshi-none)、丹参酸甲酯(methyl tanshinonate)等，其中含量较高的为丹参酮ⅡA，隐丹参酮，参丹酮Ⅰ，二氢丹参酮Ⅰ等[9]，丹参中脂溶性成分目前均以丹参酮为有效成分的参考指标。
表2 脂溶性丹参酮类化合物
NO. | 化合物 | Formula | Structure |
1 | 丹参酮I Tanshinone I | C18H12O3 | |
2 | 丹参醇 Tanshinol | C18H12O4 | |
3 | 丹参素乙素 Danshensu B | C18H12O4 | |
4 | 丹参醛 Danshen aldehyde | C18H10O3 | |
5 | 丹参酮IIB Tanshinone IIB | C19H18O4 | |
6 | 丹参酸甲酯 Methyl tanshinonate | C20H18O5 | |
7 | 丹参乙醛 Salvia aldehyde | C19H16O4 | |
8 | 丹参醇II Danshensu II | C18H16O4 | |
9 | 丹参酮IIA Tanshinone IIA | C19H18O3 | |
10 | 羟基丹参酮IIA Hydroxy tanshinone IIA | C19H18O4 | |
11 | 3-羟基丹参酮IIA 3- hydroxy tanshinone IIA | C19H18O4 | |
12 | 丹参二醇B Danshen B | C18H16O5 | |
13 | 紫丹草甲素 Methyl violet A | C19H18O4 | |
14 | 紫丹草丙素 Methyl violet C | C18H16O4 | |
15 | 隐丹参酮 Cryptotanshinone | C19H20O3 | |
16 | 隐丹参酮甲酯 Methyl Tanshinone | C20H20O5 | |
17 | 次甲丹参醌 Secondary quinone | C18H14O3 | |
18 | 3-羟基次甲丹参醌 3- hydroxy a | C18H14O4 |
2.丹参的功效
2.1补血调经
丹参有补血调经的功用，通过祛除体内积滞使气血通畅，而达到补血之功。《本草正义》云：丹参《本经》所谓益气，《别录》所谓养血，皆言其积滞既去，而正气自伸之意，而世俗以为补血之用，及止崩带下皆非古人真旨矣。《本草求真》也说丹参破瘀一语，已尽丹参功效矣，然有论其可以生新胎，调经等症，总皆有其瘀去矣。正如陈修园说的好：今人谓一味丹参功兼四物汤，其认为补血行血之品，为女科之药，而丹参之真功掩矣。故丹参补血调经作用是在祛瘀基础上而形成的。
2.2凉血消痈
本品性寒能凉血，又能活血消徵瘕积聚，有清瘀热消痈肿之功。临床常配三棱、莪术用以祛瘀消徵，《神农本草经》载其主积聚、破徵瘕；与银花、连翘等清热解毒药同用主治疮疡痈肿，《日华子本草》云丹参治恶疮疥癣、瘿赘肿毒、丹毒。
2.3凉血安神
本品凉血安神主要用以两方面：一是由于热病烦躁神昏引起的失眠，《日华子本草》言其养神定志，治血邪心烦，如热病邪入心营，用清营汤清心营之热，方中的丹参即为凉血而安神；另一方面是杂病引起的心悸失眠，《滇南本草》云：丹参养心定志、安神宁心，主健忘怔忡、惊悸不寐，如杂病血不养心，心烦偏旺之心悸失眠，用天王补心丹滋阴养血，清心安神，其中的丹参也是寓凉血安神之意。
3.丹参的药理作用
3.1对心血管系统的作用
目前，心血管疾病如冠心病、心肌梗死是全世界死亡率较高的疾病之一。长久以来，丹参在治疗多种心血管疾病如高血压、心衰、再灌注损伤引起心肌缺血等过程中展现很好的临床疗效，近些年来，对丹参在心血管方面的研究应用也日渐完善。丹参对心血管系统的影响主要体现在这几方面：①对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用。Yin等[10]通过体外心肌细胞H9C2缺氧复氧模型，发现丹参素能明显发挥抗心肌缺血再灌注损伤效应。薛凌[11]研究表明丹酚酸B能够减少心肌钙敏感受体( CaSR)在心肌细胞的表达，提示丹酚酸B可能通过调节CaSR表达而减少缺血再灌注心肌损伤。丹参酮ⅡA可以限制氧化应激、减弱心肌梗死引起的心肌纤维化，改善心功能。对于冠状动脉心脏缺血患者，注射用丹参酮类化合物可以使约80 %患者临床症状得到明显改善，近50 %患者的心电图明显改善[12]。②对血管内皮细胞的保护作用。丹酚酸A能逆转LPS诱导的人脐静脉血管内皮细胞( HUVEC)中GPx活性降低和MDA的增加，通过抗氧化作用而抑制血管内皮细胞的损伤[13]。③抗血栓作用。Moon等[14]发现原儿茶醛可抑制血小板聚集而产生抗血栓效应。丹酚酸A能显著减轻大鼠动静脉分流模型中血栓重量，抑制ADP诱导的血小板聚集，其抗血栓可能与抗血小板作用和调节血液流变学而不影响凝血系统功能有关[15]。④抗动脉粥样硬化作用。丹酚酸B可明显下调动脉粥样硬化大鼠心肌炎症标志物TNF-α和白介素6( IL6)水平，从而保护血管内皮细胞，延缓细胞因子介导的动脉粥样硬化过程[16]。丹参酮也对动脉粥样硬化的早期调节具有关键意义。越来越多的科学试验及临床证据表明[17]，丹参酮ⅡA可以预防动脉粥样硬化生成和心脏损伤。
3.2对消化系统的作用
丹参对消化系统的作用主要体现在：①对胃的影响。胃、十二指肠溃疡等消化系统疾病与活性氧之间存在一定的关系，活性氧可直接或间接损伤胃黏膜细胞，抗氧化剂对消化系统疾病具有保护作用。丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸等对生物膜过氧化均有明显地保护作用，尤以丹酚酸A的抗氧化活性最强[18]。姜静宜等[19]研究表明丹酚酸A可显著减轻缺血期大鼠胃黏膜表面区域血流量和血红蛋白氧饱和度下降程度，通过改善缺血期胃粘膜血流状况，减轻缺血再灌注引起的胃黏膜损伤。另外，丹参还可抑制胃的蠕动，从而减轻胃黏膜损伤的程度。②对肝的保护作用。丹参可改善肝脏的血液循环，有效地抑制肝脏受损细胞的脂质过氧化反应，对合成细胞色素的P450起到积极的诱导作用，降低受损细胞的RNA尿素和蛋白质DNA的生成，从而减轻肝毒物对肝细胞的损伤[20]。戴晴等[21]观察发现丹参素对转化生长因子β1( TGF-β1)诱导活化的大鼠肝星状细胞( HSCs)增殖有抑制作用。紫草酸能显著降低CCl4诱导的肝脏氧化损伤，减少血清中天冬氨酸转氨酶( AST)和丙氨酸转氨酶( ALT)的数量，增加SOD和过氧化氢酶( CAT)的数量，可被用作保肝剂[22]。另有研究表明丹酚酸B能促进肝细胞DNA合成，提高血浆纤维联合蛋白的水平，增强网状内皮系统吞噬功能和调理激素活性，对肝细胞具有保护、促进再生和抗纤维化等作用[23]。
3.3抗凝作用
丹参可抑制ADP和胶原所诱发的血小板释放和聚集功能，降低血小板表面的活性，促进纤维蛋白的溶解，从而有效地避免血栓的形成。
3.4对中枢神经系统的影响
在活化的小神经胶质细胞中，TS可以选择性抑制促炎基因表达，部分逆转抗炎基因表达，调控小神经胶质细胞的免疫反应，逆转BV2神经胶质细胞中LPS诱导的NF-κB核转位和与DNA的结合[24]。除神经保护作用外，TSI还可增强学习和记忆能力。Morris水迷宫实验显示丹酚酸A改善学习记忆损伤的主要机制可能与其抗氧化作用有关[25]。TSA对化学药物如丙酮醛类( MGO)造成的脑损伤也有很好的保护作用[26]。据报道，在短暂性大脑中动脉闭塞大鼠模型( MCAO)中，TSA可以明显减少脑梗死区域面积和局部缺血半球含水量，降低血脑屏障通透性，减弱脑水肿程度[27]。TSB明显降低灶性梗死体积、脑组织损伤和凋亡。张新乐等[28]用D-半乳糖复制衰老大鼠模型，给予丹参素后，可明显提高大鼠脑组织SOD活性，降低MDA含量，提示丹参素具抗衰老作用。
3.5抗炎作用
有研究发现，丹参煎剂对变形杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、大肠杆菌及福氏痢疾杆菌等均具有较好的抑制作用[29]。在针对PGD2生成的抑制效能筛选中，丹参的甲醇提取物呈现强抑制PGD2生成的作用[30]。丹参中的隐丹参酮、丹参酮ⅡA和丹参酮Ⅰ可有效地抑制人型结核分歧杆菌繁殖。CTS、DTS、羟基丹参酮、丹参酸甲酯、TSA、TSB及TSI等多种单体具有抗菌作用，且有抗炎、降温作用。
3.6抗肿瘤作用
丹参可通过直接杀死肿瘤细胞、抗肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡等发挥抗肿瘤作用。陶丽等[31]研究表明丹参素具有治疗非小细胞肺癌的作用，丹参素还能通过下调细胞周期素CylinB1表达而抑制胃癌MGC803细胞增殖[32]，有报道称丹酚酸B通过下调肝癌SMMC7721和HepG2细胞的AT1Ｒ的表达，减少VEGF的分泌，从而使VEGF以旁分泌的形式作用于血管内皮细胞，抑制了肝癌血管生成[33]。总丹参酮也表现出良好的抗肿瘤活性。研究证实，在人非小细胞肺癌细胞株95D细胞上，总丹参酮比TSA展现出更强的细胞毒作用和凋亡诱导作用；TSA作为丹参酮中最有效的成分，其抗肿瘤作用也被研究得最为深入。诸多体内外实验证实，TSA对多种肿瘤如肝细胞癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌及肺癌均有杀伤作用。体内试验也证实[34]，TSA可以明显抑制人非小细胞肺癌细胞系A549异种肿瘤移植的生长。除TSA外，TSI是丹参提取物中另一具有抗肿瘤活性的二萜类化合物，对多种肿瘤如肺癌、乳腺癌、白血病及结肠癌等均具有良好的疗效。有研究报道[35]，丹参酮I可以抑制结肠癌细胞生长和增殖。另一种亲脂类丹参酮DTS也被报道具有抗肿瘤活性[36]。
3.7抗氧化作用
研究表明丹参水提取能显著提高肝细胞、血浆中红细胞SOD的活力；显著降低血清及肝中过氧化脂质的量；阻断超氧阴离子产生和清除超氧阴离子来实现其清除氧自由基、抗氧化的作用[37]。丹酚酸A可激活色素上皮细胞Nrf2/HO1信号通路，并可通过激活Akt/mTORC1信号通路防止氧化应激[38]。
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3. 设计方案和技术路线
研究方案：
1. 丹参茎叶提取物对糖尿病肠病体外模型的保护作用
1.1 细胞培养
4. 工作计划
2022.12～2022.01 查阅文献，确定研究方案。
2022.01～2022.03 实验前期准备工作。
2022.03～2022.04 按既定方案进行细胞实验并记录实验数据 。
5. 难点与创新点
1. 首次对丹参茎叶防治糖尿病肠病资源价值进行探讨；
2. 体内外模型结合对丹参茎叶防治糖尿病的作用机制进行研究
3. 对丹参茎叶资源价值开发利用提供依据。
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