1. 研究目的与意义
研究内容：二甲双胍对离体低糖微环境下CD4 T细胞葡萄糖摄取能力及糖酵解水平的影响。
从脾脏原代分离的CD4 T细胞，在体外低糖微环境的条件下（低糖培养基或与B16F10-HK-OE共培养），应用anti-CD3/anti-CD28mAbs激活CD4 T后，观察二甲双胍：1. 对低糖肿瘤微环境中CD4 T细胞摄取葡萄糖能力的影响：1) 二甲双胍对CD4 T细胞Glut-1表达水平的影响；2) 二甲双胍对CD4 T细胞摄取葡萄糖能力的影响。
2. 对糖酵解水平的影响：1) 二甲双胍对CD4 T细胞糖酵解相关酶（GPD2、GAPDH和PK）活性的影响2) 二甲双胍对CD4 T细胞糖酵解相关酶（GPD2、GAPDH和PK）蛋白水平的影响3) 二甲双胍对糖酵解中间代谢产物（G6P，1、6-FDP和PEP）水平的影响。
2. 文献综述
二甲双胍抗肿瘤机制的研究进展摘要：二甲双胍是在临床中治疗2型糖尿病常用的一线治疗药物，近年研究发现，二甲双胍不仅能降血糖，还能抑制肿瘤细胞增殖，其抗肿瘤机制的焦点主要集中在激活单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶途径、降低循环中胰岛素及胰岛素样生长因子水平、诱导细胞周期停滞、抑制血管生成及炎症反应、抑制氧自由基生成、抑制肿瘤干细胞增殖、联合相关药物增强对放疗及化疗的敏感性等，以此抑制肿瘤细胞增殖，减少糖尿病患者肿瘤的发病风险。
目前，二甲双胍的抗肿瘤作用及其分子机制的研究已成为热点，本文就近年来二甲双胍抗肿瘤的机制进行简要综述。
[关键词]二甲双胍；肿瘤；单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶;雷帕霉素靶蛋白;氧自由基;肿瘤干细胞1.二甲双胍与肿瘤二甲双胍不仅是一种含有两个甲基的双胍类降糖药，也是一种胰岛素增敏剂。
3. 设计方案和技术路线
研究方案：1）CD4 T(no-treg)细胞的分离、纯化、培养及活化″ 从整体模型肿瘤组织中分离CD4 T细胞，直接用于流式检测相关指标：①新鲜取材的组织标本置于24孔板机械剪碎，或成为匀浆状；②每孔加入1ml~2ml消化液（每ml消化液含0.5μg胶原酶IV，0.5μg透明质酸酶；0.5μg脱氧核糖核苷酸酶，37℃消化60min；③消化结束后将组织碎块转移到100目无菌钢网中研磨，收集单细胞悬液，1500rpm离心5min，弃上清；④用含1%小牛血清的PBS重悬细胞，沿管壁缓慢加入预置Ficoll的华氏管，22℃恒温400g离心30min；⑤小心吸取中间白膜层单个核细胞，含1%小牛血清的PBS洗两遍（1700rpm，5min离心）。
弃上清，再加入适量含1%小牛血清的PBS以2106/ml细胞浓度重悬细胞，至于冰上备用；⑥T细胞分选试剂盒分选TH1CD4 T细胞备用。
从腹腔感染的C57BL/6小鼠淋巴结中分离TH1CD4 T细胞，主要用于离体相关细胞实验，分离方法同上。
4. 工作计划
2022年1月~2月：查阅文献，文献综述思路形成，实验方案制定；2022年2月：初步试验、实验条件选择；2022年3月~6月：进行实验研究，整理数据，撰写论文。
5. 难点与创新点
1. 创新性地从TIL-T糖酵解的角度研究二甲双胍抗肿瘤的作用机制，为其尽早应用于肿瘤临床治疗提供依据；2.创新性地从临床常用口服降糖药物中寻找针对低糖肿瘤介导的肿瘤免疫逃逸的新药，为发掘肿瘤免疫治疗药物的研发提供新思路。
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