1. 研究目的与意义
毕业设计的内容：
本论文研究了大鼠服用不同剂量的六神丸经过60天的服药期和15天的恢复期后，肝脏组织中总砷和各形态砷化合物的分布情况。采用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法（HPLC-HG-AFS）对大鼠给药六神丸后肝脏中的砷形态进行研究分析，为评价六神丸的安全性提供依据。
2. 文献综述
砷元素形态分析的应用研究进展
摘要：砷是一种广泛分布于自然界的元素，大量含砷化合物以不同的形态存在于与人类密切相关的水、空气和食物中。因此研究砷的总量和形态分析有非常重要的意义。本文对近年来砷元素提取、分离、测定技术进行了综述。
关键词：砷元素 形态分析 应用研究
引言：
砷是排列在元素周期表中的第33号主族元素, 是一种有毒的非金属元素,在自然界中主要以硫化物的形式存在,还有极少量的自然砷和金属砷化物;人工合成的砷化合物主要用于饲料、农药、药物、木材防腐剂等[1]。
砷元素常见的形态有As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA(一甲基砷酸)、DMA (二甲基砷酸)等,由不同形态砷的半数致死量可以判断,无机砷的毒性比较大,甲基化砷的毒性较小,不同形态的砷化合物毒性差异很大, 其毒性依次为H3As>As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MAA>DMA>TMAO>砷糖>AsC>AsB[2]。
一、砷元素的提取
对砷的形态进行分析前需对样品预处理,提取砷化物再分析。
一般的生物样品砷形态分析前处理过程包括样品采集、组织解剖与分离、去离子水清洗、冷藏保存、冷冻干燥、低温研磨以及形态提取等过程。样品前处理主要步骤如下:首先用刀片刮去附生物质,再先后用自来水和去离子水反复冲洗干净。对样品冷冻干燥后,需要通过人工或机器研磨至极其细小的颗粒态,以确保细胞(细胞膜)被破坏,尽量保证样品的同质性,因为颗粒粒径的大小及均匀程度直接影响到砷形态提取效率和数据的平行性[3]。
常用的提取方法：超声振荡提取法、微波辅助法、固相萃取法等，
常用的提取液：甲醇-水、抗坏血酸-磷酸、磷酸、盐酸等，目前,砷的形态分析中的提取方法见表1
表1砷的形态分析中的提取方法
样品 | 提取方式 | 提取液 | 提取条件 | 提取率 | 参考文献 |
中药 | 超声振荡提取 | 甲醇-水 | 超声提取30min以4500r/min转速离心15min,取上层清液过滤 | 73.7 | ［18］ |
土壤 | 微波辅助提取 | 抗坏血酸-磷酸 | 称取样品0.3000g，置于微波提取罐中，加入磷酸提取剂30ml,进行微波提取，微波功率60w,保持10min | 92.6-110.0 | ［19］ |
土壤和沉积物 | 超声振荡提取 | 磷酸 | 在指定时间以300r/min速率预振荡，再以500r/min转速振荡5min | 80-120 | ［２0］ |
雄黄 | 固相萃取法 | 盐酸 | 超声10min后静置过夜，用盐酸分3次转移至100ml容量瓶中，以去离子水定容。摇匀后稀释，在真空固相萃取装置中提取分离 | 77.7-102.4 | ［２1］ |
大气颗粒 | 超声振荡提取 | 磷酸 | 在不同磷酸浓度及超声时间下进行提取，以确定最佳提取条件，再经不低于1mol/L的磷酸溶液超声提取40min | 91.8 | ［２2］ |
鱼和贝壳 | 微波辅助提取 | 硝酸-过氧化氢 | 加入3ml硝酸和1ml过氧化氢，拧松离心管帽，于750w微波萃取3-4min，重复两次，每次间隔冷却10min,用去离子水定容 | 32,5-99.4 | ［２3］ |
海鲜 | 微波辅助提取 | 甲醇-水 | 在80℃中微波6min后，以3500r/min转速搅拌5min | 85.0-105.0 | ［２4］ |
超声振荡提取法、微波辅助法、固相萃取法等是常用的提取方法,提取效率较高。其中超声振荡提取和微波辅助提取是应用最广的提取方式,微波辅助提取可以有选择性地将样品中各种形态的砷萃取出来,具有高回收率、高选择性和低溶剂消耗等优点[4]。
常用的提取剂有甲醇-水和无机酸等,其中甲醇-水提取剂主要提取中药、海鲜和海产品等有机体中的有机砷,提取率在73.7% -110%之间;磷酸、磷酸-抗坏血酸、硝酸-过氧化氢和盐酸提取土壤、沉积物、大气颗粒等中的无机砷,提取率分别60.0%-91.8%,92.6%-110.0%,93.2% -102.7%,32.5%-103.7%, 77.7%-110.5%之间。由表结果可知:各提取剂的提取率由大到小的顺序为磷酸抗坏血酸、硝酸-过氧化氢、盐酸、磷酸、甲醇-水。
二、砷元素的分离
常见砷的分离方法有共沉淀法、毛细管电泳法(CE)、氢化物发生法(HG)、高效液相色谱法(HPLC)和流动注射分析法(FIA)等。
毛细管电泳法是以毛细管为分离通道,用高压直流电场作为驱动力的液相分离技术,因其不需要填料,对已经存在的化学平衡影响相对较小,并且试样用量少,分离效率高,分析的速度快[5]。如张景红[6]等采用高效毛细管电泳法测定雄黄微生物炮制液中砷的形态成分，雄黄炮制液中4种形态砷能实现完全分离，日内迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.61%～0.82% ,1,26%～3.12%,回收率范围为97.8%～103.2%。
高效液相色谱法(HPLC)因可通过改变固定相和流动相来获得不同化合物的最佳分离，并且可分离低挥发性或非挥发性的砷化物而得以广泛应用，分离砷形态模式有空间排阻色谱、离子对色谱，其中最常用的有两种分别是：阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。原理是基于待测砷离子与流动相中的相关离子固定相上键合位置的竞争来实现分离的，但在上柱前必须转化为砷的离子型化合物。阴离子交换常用来分析As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsB和AsC。阳离子交换常用来分析AsB、AsC、TMAO和TMA [7]。
三、砷元素的检测
常用砷的检测方法是原子吸收光谱法和电感耦合等离子体质谱法等。在砷的形态分析中往往将分离技术与检测技术联用,如共沉淀-氢化物发生-原子吸收光谱法、毛细管电泳-紫外检测法、氢化物发生原子荧光光谱法、氢化物发生-电感耦合等离子体原子发射光谱法、高效液相色谱等技术[8]，与单一的检测技术相比，在灵敏度、准确度和分析速度等方面都有很大的改善，在形态分析中发挥了重要的作用。
氢化物原子荧光分光光度法具有原子吸收和原子发射光谱两种技术的优势,具有分析灵敏度高、干扰少、线性范围宽和可多元素同时分析等特点,但在砷化合物的形态检测方面,该方法仅能应用于检测AsⅢ和AsⅤ两种无机砷形态[9]。如向明钧[10]等采用氢化物发生-原子荧光光谱法测定7种中草药中不同形态的水溶性砷,砷含量在10-100ng /m L浓度范围内线性关系好,回收率在91.4%-106.4%之间。
与原子吸收光谱联用：原子吸收光谱法用于测定元素的总量, 需要与其他仪器联用后才能用于元素的形态分析。在20世纪80年代, 火焰原子吸收光谱已经与高效液相色谱的检测器联用来分析砷的形态, 但由于其灵敏度较低、背景噪音高, 不能单独用来检测砷的含量, 因而逐渐被高灵敏度的石墨炉原子吸收取代[11]。
离子色谱-原子吸收/原子发射光谱：由于电感耦合等离子体发射光谱具有灵敏度高、分析速度快，广泛用于痕量元素测定。而结合氢化物发生技术又能有效的改善As、Sn等的检出限,如采用氢化物发生ICP-AES法对土壤样品中痕量As的测定进行研究,对影响氢化物发生ICP-AES法测定As分析信号的主要因素的作用预还原剂的加入量，载气速率，等离子体的工作效率等进行了实验，选定了发生氢化物及仪器工作的最佳条件。采用HNO3、H2SO4处理样品，在选定条件下对土壤标准物质进行分析，结果与标准值吻合较好。该法的检出限为（*10-6）As为0.07[12]。
电感耦合等离子体-质谱（ICP-MS）有较高的检测灵敏度，如宋旭[13]等采用HPLC-ICP-MS法分析测定药用植物中的形态汞，样品回收率 72.83%-98.25%,精密度（RSD）(n=6)均小于15%,甲基汞、乙基汞、二价汞的检出限分别为0.125mg/kg,0.250mg/kg,0.125mg/kg。如张好华[14]应用HPLC-ICP-MS对三碘化砷、五氧化二砷、甲基砷酸、和二甲基砷酸等四种砷形态进行测定，并对黄芪、大黄、黄芩、何首乌、地黄等五种中药炮制前后砷形态的变化进行了分析，线性相关系数（ｒ）均大于0.9980,其重复性、稳定性和回收率的RSD分别为1.21%～4.31%、1.78%～4.97%、1.19%～5.57%，加标回收率83.15%～118.32%。
与原子荧光光谱联用：原子荧光光谱法是原子光谱法中的一个重要分支,也是近几年报道最多的一种砷的检测方法。AFS是将含砷样品用硼氢化钾还原为砷氢化物,导入原子化器原子化,不需价态分离即可测定。HG-AFS可以识别As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA等砷形态,其灵敏度比吸光光度法高,且光谱线简单、选择性好、线性范围宽,可适用于多元素同时测定。另外,AFS和HPLC-ICP-MS相比, 其分析成本低、灵敏度相当,而仪器价格又远远低于ICP-MS。将HPLC和AFS联用可以利用色谱技术将不同形态的金属化合物进行分离,再利用原子荧光检测技术对各形态的金属化合物进行检测,充分利用原子荧光的高灵敏度、专一性和抗干扰能力的优势,开发更多应用领域与待测元素,HPLC-AFS法是一项非常有前途的分析方法[15]。如曹晓刚[16]等采用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光 ( HPLC-HG-AFS) 方法测定西藏冬虫夏草中4种砷形态化合物As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(Ⅴ)，在0～100μg/L范围内，各砷形态化合物均呈良好的线性关系，相关系数r均在0.999以上。然后对0.5、1.0、2.0 mg/kg这3个水平进行方法验证,发现其加样回收率在87.0%～94.0%之间,RSD值在1.0%～4.5%之间,而且As (Ⅲ)、DMA、MMA和As(Ⅴ)的检出限分别为 0.01、0.005、0.005、0.01 mg /kg。如王亚[17]等采用高效液相色谱／氢化物发生－原子荧光光谱法检测微藻中的砷形态，As (Ⅲ)、二甲基砷酸、一甲基砷酸和As(Ⅴ)的线性相关系数分别为0.9999、0.9996、0.9997和0.9994,检出限分别为0.19、0.40、0.34、0.52μg/L。
二、总结与展望
本文通过对砷化合物的提取、分离及测定技术进行综述，则对于砷形态分析研究需要开发准确、快速、稳定的分析技术。高效液相色谱法是元素形态分离的有效途径，在分离和测定方面的特点使其在砷的形态分离中得到广泛的应用。在今后的分析检测中，HPLC及其联用的方法有较大的探索空间。
参考文献
[1]肖亚兵等.固相萃取/高效液相色谱法对饲料中阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷的同时测定[J].分析测试学报.2008,27（9）
[2]高杨,曹煊等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定干海产品中砷化学形态[J].分析化学研究报告.2009,37(12）
[3]杨芬,韦朝阳,刘金鑫.砷形态分析的样品前处理技术研究进展[J].环境科学与技术.2016,10(39),79-86
[4]郑光亚,宋佳,邓跃全等.砷形态分析的研究进展[J].理化检验.2015,04(51),560-566
[5]刘成新,肖志明等.食品和饲料中砷的形态分析研究进展[J].农产品质量与安全.2017,03,49-54
[6]张景红,李红玉.高效毛细管电泳法测定雄黄微生物炮制液中砷的形态成分[J].时珍国医国药.2011,22(2）
[7]刘成新,肖志明等.食品和饲料中砷的形态分析研究进展[J].农产品质量与安全.2017,03,49-54
[8]田靖,陈昌云.砷形态分析技术研究进展[J].化学分析计量.2011,20(5)
[9]王亚,张春华等.高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法检测紫菜中的砷形态[J].分析实验室.2013,05
[10]向明钧,李银保.氢化物发生-原子荧光光谱法测定7种中草药中不同形态的水溶性砷[J]光谱实验室.2010,27(2)
[11]杨慧,王富华等.砷元素形态分析研究进展[J].广东农业科学.2010.4
[12]杨兴龙.食品中砷检测方法的比较与应用[D].苏州大学.2013.5
[13]宋旭 ,孔维恒等.HPLC-ICP-MS法分析测定药用植物中的形态汞[J].现代仪器与医疗.2013,19(2)
[14]张好华.HPLC-ICP-MS研究中药炮制对砷形态的影响分析[J].亚太传统医药.2014,10(10)
[15]寿淼钧,李伟等.液相色谱-原子荧光联用技术与元素形态分析[J].分析仪器.2017,04,1-5
[16]曹晓钢,王君等.HPLC-HG-AFS法分析西藏冬虫夏草中的砷形态化合物[J].中成药2015,37(9)
[17]王亚,张春华.高效液相色谱/氢化物发生－原子荧光光谱法检测微藻中的砷形态[J]分析科学学报.2014,30(1)
[18]郝春莉,王庚,余晶 晶等.分析测试学报[J]2009,28(8):918-921
[19]彭珏,张朝阳,卢普相,等.生态环境学报[J],2011.20(4):722-726
[20]GEORGIADIS M,CAI Young,GABRIELE H M S.Environmental Pollution[J].2006,141
[21]许珺辉,王洪玮,崔蓉,等.药物分析杂志[J].2007,37(3):395-399
[22]贺婷婷,李柏,徐殿斗等.Chinese Journal of Analytical Chemistry[J],2011,39(4)
[23]李卫华,刘玉海.分析化学[J].2011,39(12):1912-1916
[24]LEUFROY A,LAURENT,DUFAILLY V,et al.Talanta[J],2011,83:770-779
3. 设计方案和技术路线
研究方案：
4. 工作计划
实验进度：
2018年1月-3月：查阅文献，设计实验方案；
2018年3月-5月：大鼠给药，肝脏组织收集，样本处理与检测；
5. 难点与创新点
本实验采用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法（HPLC-HG-AFS）对大鼠给药六神丸后肝脏中的砷形态进行研究分析。
以上是毕业论文开题报告，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
