1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
我国是世界水稻主产区，年产量达2000亿公斤，保障我国水稻的高产、优质对于维护社会稳定和经济的快速发展具有重要作用。二化螟（ Chilo suppressalis Walker）属鳞翅目螟蛾科，是水稻生产上重要的钻蛀性害虫[1]。20世纪 90 年代以来，由于水稻栽培制度的改变和杂交水稻的推广，中国长江中下游地区和浙江东南稻区二化螟危害日益严重[2]。化学防治是控制二化螟为害的重要途径。但由于防治水稻螟虫必须考虑水田用药的安全性、防治钻蛀性害虫有效性及粮食作物可承担的药用成本[3]。因此用药受到很多限制，防效用药相对单一，抗药性发展迅速[4]。江浙等地二化螟相继对六六六、杀虫单和三唑磷等主要水稻螟虫防治药剂产生高水平抗性。化学杀虫剂的不合理使用是造成二化螟对许多杀虫剂产生不同抗药性的原因，而寻找新的杀虫剂靶标及新的防治手段显得尤为重要[5]。
瞬时感受器电位通道（transientreceptor potential,TRP channels）是一类位于细胞膜上的重要的阳离子通道。该离子通道家族存在于各种动物体内，包括蠕虫，果蝇以及人类等[6]。TRP channels可被多种机制激活，参与到各个感觉的形成过程中，例如视觉、嗅觉、听觉、温度感觉、机械感觉[7]。TRP通道家族首次发现于果蝇的视觉传导系统中。视觉传导对于果蝇的环境感知能力非常重要，其影响果蝇的一系列的行为活动。最早发现的TRP突变体是Cosens于1972年在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）体内发现的A-type突变体，它是一株飞行过程中视觉行为缺陷的果蝇突变体之一[8]。该突变体与野生型的光诱导反应不同，它们对于强光刺激表现出瞬时的而非持续性的反应[9]。1975年，Minke等基于电生理的表现型将其命名为Dmtrp（transientreceptor potential）[10]。这也是该通道家族命名的来源。从最初发现描述A-type/trp突变体至此后的二十年内，对该突变体一直没有分子功能的研究，直到1989年，Montell等克隆并鉴定了DmTRP，发现将其表达于突变体可以挽救其对光反应缺陷。对DmTRP的结构预测发现其与已知的离子通道结构相似，这说明DmTRP可能是一个通道蛋白[11]。但是，如果这是一个通道的话，通道类型却不清楚，因为在突变体中也存在光诱导产生的光感受器膜电位。随后的研究发现，在突变体果蝇响应光刺激时会出现钙离子流入的降低，这说明DmTRP响应光刺激时可能是一个钙渗透性离子通道[12]。然而，仍然不能说明DmTRP自身是一个通道，也可能是调控一个内源性通道。此后，两方面的研究表明，DmTRP的确是一个孔道形式的钙离子渗透性通道亚基：第一，将DmTRP在异源表达系统中会出现一种新颖的离子传导，对钙离子的选择性适度高于对钠离子的选择性；第二，DmTRP孔道区域的突变会降低对钙离子的选择性。
自果蝇DmTRP克隆鉴定后，关于TRP通道家族基因的研究报道越来越多。由于缺少统一的命名规则，常出现同一个基因因为发现的实验室不同而命名各异，给研究增添了不必要的麻烦。2002年，以Montell为首的TRP通道家族命名委员会提出了一套新的命名方法。与其它经典的离子通道不同，TRP通道家族的鉴定只依据其序列和结构的同源性，共划分为七个亚家族：TPRC、TRPA、TRPM、TRPV、TRPN、TRPP和TRPML。TRPC亚家族的C代表标准的（canonical）或者经典的（classical），该亚家族包含最先在果蝇中发现的DmTRP，并且该家族的基因与DmTRP具有极高的同源性。其它各个亚家族的命名是以该亚家族中首次发现的成员的首字母来进行的，TRPV亚家族的V代表vanilloid，以纪念该家族第一个成员TRPV1（vanilloid receptor 1，VR1）被vanilloid（辣椒素类物质）类化学物质所激活；TRPM亚家族中的M代表melastatin，源于该家族第一个成员TRPM1（tumor suppressor melastatin）被克隆的细胞名；TRPA亚家族中的A代表ankyrin，源于TRPA1(ankyrin-like with transmembranedomain 1, ANKTM1)基因；TRPN则是该亚家族唯一成员NompC（No Mechanoreceptor Potential C）的首字母；TRPP中的P代表polycystic，源于首次发现的TRPP2（polycystic kidney disease-related protein 2，PKD2）；TRPML中的ML代表mucolipin，代表首次发现的TRPML1（mucolipin 1）。同时基于TRP通道家族序列和拓扑结构的差异，该家族又可划分为组1和组2两类。组1包含前五个亚家族，且与果蝇DmTRP基因具有较高的同源性；组2与组1的同源关系较远，其中包含其余的两个亚家族，TRPP和TRPML，这两个亚家族在跨膜序列上存在较高的同源性。TRP通道与电压门控钾通道（Kv）具有相同的进化模式，由六次跨膜结构域（TM1-TM6）以及位于胞内的N末端和C末端形成一个亚基，并由四个相同或相似的亚基形成功能结构域。在TM5与TM6之间形成孔道区域，TM1-TM4以及胞内的N末端和C末端被认为含有控制通道开放的调控元件[13]。在组1成员中，除TRPM亚家族外，均具有TRP通道的共有结构特点，即在它们的N端都具有多个锚蛋白重复序列(ankyrin repeats, ARs)，但不同通道包含的ARs不同。同时，TRPC、TRPM和TRPN亚家族在第六跨膜结构域后还含有一个TRP结构域（TRP domain），最保守的部分分为TRP box 1（EWKFAR）和TRP box 2（LPPPFN）。有些通道的C末端还具有酶结构域，因此又称为通道酶，如哺乳动物的TRPM2具有一个Nudix水解酶结构域[14]。组2成员TRPP和TRPML在第一和第二跨膜结构域（TM1-TM2）存在着一个较大的胞外环，而组1成员却不存在。另外其它一些结构域和基序都会影响TRP通道的功能，例如coiled coils (cc)、钙调素结合位点、EF hands或者氧化磷酸化位点等，它们的种类和数量多种多样，同一个亚家族中的不同成员中也会不同。
2. 研究的基本内容和问题
2.1 目标：
通过将果蝇TRP通道家族的蛋白序列与二化螟基因组以及转录组数据进行TBLASTN比对后，我们鉴定得到了编码二化螟TRP通道的基因片段。通过进一步的PCR和RACE实验，克隆得到了13个二化螟TRP通道家族基因。根据果蝇中TRP通道的分类方法，将鉴定克隆得到的13个二化螟通道基因划分为TRPC、TRPA、TRPV、TRPN、TRPM、TRPML6个亚家族，并对其进行基因序列分析和同源基因聚类分析及进化树的构建。
2.2 内容：
3. 研究的方法与方案
3.1 研究方法：二化螟总RNA的提取及cDNA合成，基因克隆，基因序列分析，进化树构建
3.2 技术路线:基因克隆
3.3实验方案：
4. 研究创新点
通过克隆二化螟的13个TRP通道基因将这13个TRP通道与其对应的同源基因进行多序列比对以及同源性比对后进行TRP亚家族之间的基因在不同物种间的同源性比较及亚家族中基因之间的同源性比较。
5. 研究计划与进展
2016.06-2015.07 查阅文献、确定实验方案与方法；
2016.07-2015.08 昆虫饲养、实验样品的获取；
2016.12-2017.02二化螟幼虫总RNA的提取及cDNA合成和基因克隆
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