热应激对小鼠海马细胞HT-22增殖与凋亡的影响与机制研究开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

热应激(heat stress)指机体产生的非特异性的综合应答反应来抵抗不利的热环境，一般都有显著的高热和脱水等生理行为上的一系列变化[1]。热应激反应的产生需要机体生存温度超过一个上限，该上限也称为生存温度舒适区。有研究表明[2]小鼠在 40 ℃温度下进行刺激60min， 虽然其生命体征仍能在该范围内保持平稳，但其空间参考与工作记忆能力因热应激而显著下降。另外小鼠自身的学习记忆会被热应激影响，在热应激后早期0～6 h内学习和记忆能力表现为受损，但恢复12h时已经基本恢复至正常水平，24h后完全恢复至正常水平 [3]。

家兔受到热应激后体温若升高2~3℃，则其兔脑组织和视网膜的HSP70和HSP90合成蛋白表达量升高。在家兔视网膜细胞内诱导产生的HSP70可经轴突转运至视神经。同理啮齿类动物在全身发生高热时都会出现HSP表达升高的情况，体内和体外研究均发现，脑组织中也有HSP70 的诱导，以大脑微血管系统最为明显[4-5]。目前，已经描记出大鼠视网膜和角膜上皮在全身高热的情况下，HSP70蛋白和mRNA的表达图谱。早期的研究集中在蛋白质水平， 即哺乳动物脑组织HSP70的快速合成。Nthern Blotting 检测发现，家兔体温升高 2~3℃， 1h后脑组织内即有大量的2.7kb的 HSP mRNA的 表达， 而对照组动物仅有2.5kb的mRNA 表达。家兔基因组测序证明其中中含有HSP70基因家族，包括HSC70和HSP70[6]。在脑组织中 2.7kb HSP70 转录呈一过性，并且与体温升高和降低呈平行状态，而2.5kb HSC70mRNA则几乎没有改变，且这种一过性的转录情况在对照组中没有见到，所以应该建议在以后的研究中进一步研究神经系统内 HSP基因在不同脑区以及不同类型神经细胞的表达及其原因[7]。哺乳动物神经系统热应激基因的表达图谱分析可以帮助我们进一步理解某些脑细胞对不同形式损伤和神经系统疾病的易患性。

下丘脑是体温调节的基本中枢。在20世纪40年代，采用定向刺激法和局部损毁法证明下丘脑前部为散热中枢，后外侧部为产热中枢。机体的温度感受器在接受内、外环境温度的刺激信号后，通过体温调节中枢的活动，引起骨骼肌、各种分泌腺、 皮肤血管等组织器官活动的改变，调整机体的产热和散热的过程，使体温维持在一个相对恒定的水平。FOS蛋白作为神经元活动状态的标记物，目前国际上已被广泛采用[8]，24℃时，FOS阳性细胞较少，分布无明显核团；热应激后，大鼠中枢内多个部位出现FOS表达。34℃热应激时时，下丘脑室旁核（PVN ）和下丘脑视上核（SON）内有少量的FOS阳性神经元表达。38.5℃热应激时，PVN 和SON内的FOS阳性细胞明显增加，达到峰值，结合大鼠的行为学表现，此时大鼠体内的渗透压已经发生改变，其处于高渗状态，而SON和PVN不光是维持机体水盐平衡的重要中枢，同时也参与对机体损伤、应激等反应的调节，研究表明此时FOS蛋白集中分布于这两个核团，正说明了这一点。42℃时SON和PVN的FOS阳性神经元表达明显减少，可能是由于当温度到达42℃时，机体受到损伤，机能处于抑制状态的原故。说明环境温度升高到达38.5℃时，机体处于兴奋状态，FOS表达增加；温度到达42℃时，机体反而处于抑制状态，FOS表达也减少[9-11]。所以在热应激温度轻微上升是FOS基因表达是升高的。而强烈的热应激会导致FOS表达的下降。

海马体（Hippocampus），又名海马区、海马回、大脑海马，海马体主要负责学习和记忆，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中，它是组成大脑边缘系统的一部分，担当着关于记忆以及空间定位的作用。热应激对于动物各个系统都有很大的影响，会导致鸡采食量的下降，猪精子活力的下降。但是对于记忆中枢海马的研究尚不深入，本实验就是基于对于海马神经元细胞的体外培养和热应激实验来探究热应激对于海马神经元细胞的影响。

[1]Harikai N,Tomogane K,Miyamoto M, Shimada K, Onodera S, Tashiro S. Dynamic responses to acute heat stress between 34 degrees C38.5 degrees C,acteristics of heat stress response in mice. Biol Pharm Bull [J]. 2003 May;26(5)701-8.

[2]杨芬. 热应激对小鼠脑电图、空间学习记忆及海马超微结构的影响[D].第四军医大学，2006.

[3]王衍，李积胜，赵爱源，等.热应激预处理对热应激小鼠脑体功能影响的时程变化[J].中国行为医学科学，2006，15(9)774.

[4] 聂小寒. 铝致大鼠海马神经元凋亡与突触可塑性损伤的关系及凋亡过程中caspase途径研究[D].山西医科大学,2015.

[5]王衍,李积胜,赵爱源,等.热应激预处理对热应激小鼠脑体功能影响的时程变化[J].中国行为医学科学,2006,15(9)774.

[6]Lu D, Das DK. Induction of differential heat shock gene expression in heart,lung, liver, brainkidney by a sympathomimetic drug,amphetamine. BiochemBiophys Res Commun [J] .1993 Apr 30;192(2)808-12.

[7]Flanagan SW, Ryan AJ, Gisolfi CV, Moseley PL. Tissue-specific HSP70 responsein animals undergoing heat stress [J]. Am J Physiol. 1995 Jan;268(1 Pt 2)R28-32.

[8]Nelson RJ, Ziegelhoffer T, Nicolet C, Werner-Washburne M, Craig EA. The translation machinery70 kd heat shock protein cooperate in protein synthesis [J]. Cell. 1992 Oct 2;71(1)97-105.

[9]Choi HS, Lin Z, Li BS, Liu AY. Age-dependent decrease in the heat-inducible DNA sequence-specific binding activity in human diploid fibroblasts [J]. Biol Chem.1990 Oct 15;265(29)18005-11.

[10]Tsay HJ, Li HY, Lin CH, Yang YL, Yeh JY, Lin MT. Heatstroke induces c-fos expression in the rat hypothalamus [J]. Neurosci Lett. 1999 Feb 26;262(1)41-4.

[11]Bratincsk A, Palkovits M. Activation of brain areas in rat following warmcold ambient exposure [J]. Neuroscience. 2004;127(2)385-97.

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1、实验设计

本实验将大鼠的海马神经元细胞在42.5摄氏度培养箱下培养，实验分为三组

（1）对照组（该组培养条件为37.5摄氏度下正常培养）

（2）8小时热应激组（3）一小时热应激组。

培养到对数生长期进行细胞生长状态观察以及WB，PCR等相关蛋白及基因的表达量的测定来得到最终的结果。本论文拟从以下方面分析细胞凋亡和增殖的变化，以海马神经元细胞HT-22为研究对象，用分组光照进行处理，提取细胞的mRNA、DNA和蛋白。

（1）检测细胞活力的变化

将培养至对数期的细胞进行胰酶消化，之后将细胞从细胞板上吹打下来，800 rpm离心5分钟，之后将细胞加入营养液吹打混匀，进行细胞计数。以每100 l 1万个细胞进行铺板。然后光照处理。24 h后进行加入CCK-8并在酶标仪中检测细胞活力。通过吸光度的改变判断细胞活力是否增减。

（2）通过流式检测细胞增殖和凋亡的变化

用检测细胞增殖和凋亡试剂盒处理细胞后用流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡程度。

（3）检测REV-ERB以及钟基因蛋白水平表达

购买相关的抗体，用WB的方法分析这些关键基因的蛋白表达是否发生变化。

(4）检测GSK-3的酶活性

购买GSK-3酶活性检测试剂盒来测定酶活性在光照前后的变化。

（5）购买GSK-3激动剂或者抑制剂，进行功能缺失实验。

通过GSK-3的激动剂或者抑制剂处理细胞之后，继续重复相关表型到蛋白的工作来验证。