猪流行性腹泻病毒细胞受体的真核表达开题报告

 2023-02-19 20:33:19

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)属于冠状病毒科，α冠状病毒属，为有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV的细胞受体是猪小肠绒毛细胞表达的氨基肽酶N(aminopeptidase N, APN)，该病毒主要损伤猪的肠道粘膜，PEDV可以引起猪的急性接触性肠道传染病，临床上表现以水样腹泻、脱水、呕吐为主要特征的急性肠炎。PEDV在2010年底，在我国南方省市的暴发，造成了我国养猪业巨大的经济损失，但事实上，不仅是我国，PEDV给全球养猪业也造成了巨大的经济损失。PEDV对7日龄以下的哺乳仔猪致死率极高，对其他猪群致死率低，但是其造成的经济损失不只是由于哺乳仔猪的死亡而带来的直接经济损失，也来源于其对猪场其他类型的猪危害而导致的间接经济损失，如生产母猪群体较长一段时间内的生产性能下滑，保育和育肥猪的死亡率与料肉比提供高、日增重下降。本课题旨在通过将PEDV细胞受体基因构建的真核表达质粒转染体外培养的猪睾丸细胞（Swine testicle cells，ST cells）来研究PEDV细胞受体在感染猪体内的表达情况，及其对PEDV复制的影响，从而为PEDV感染机制和防控措施提供理论基础和新的思路。

PEDV虽然引起了全世界学者的广泛关注，针对于PEDV致病机制和免疫逃避的国内外研究也非常多，但大多数学者都将研究的重心侧重于PEDV病毒结构本身的研究，而对于PEDV细胞受体的研究比较少。PEDV的全基因组长度为28033个核苷酸（不含poly A尾），含有7个开放阅读框（Open reading frame，ORF）：ORF1a，ORF1b，纤突蛋白（Spike, S），ORF3，囊膜蛋白（Envelope, E），膜蛋白（Membrane, M）和核蛋白（Nucleocapsid, N），其中S、E、M、N为结构蛋白，ORF1a、ORF1b、ORF3a和ORF3b为非结构蛋白。E蛋白，由76个氨基酸组成，是位于病毒囊膜上的小胞膜蛋白，在病毒的组装和出芽时发挥作用。M蛋白是膜糖蛋白，能够介导机体产生α干扰素。N蛋白是由441个氨基酸组成的蛋白，与PEDV的RNA相互缠绕而形成核衣壳，其基因结构稳定，而且保守性强，被很多国内外的研究者作为研究诊断开发的首选。从目前的研究来看，PEDV感染细胞的途径是S蛋白与小肠绒毛上皮细胞中的受体APN结合，通过膜融合的过程侵入细胞内，在细胞内完成脱囊膜和脱壳后，在小肠绒毛上皮细胞中完成复制、转录及病毒粒子的装配过程。所以对于PEDV结构本身的研究非常必要，但对于细胞受体APN的研究也是不可或缺的。综合国内外研究者们对于PEDV的细胞受体的研究来看，已经取得了很大的突破，但是仍然有很长的一段路需要后人继续探索。在对于细胞受体的研究过程中，Oh J S等研究者首先提出APN可能是PEDV感染细胞的受体，并通过覆盖病毒蛋白结合试验，PEDV在Vero细胞上的促感染试验对假设进行了进一步验证，证明APN可能是PEDV的受体。而后，我国的研究者们也开始对APN开展研究，杨殿奎等研究者将APN基因成功转染PEDV非许可性细胞(Madin-Darby cannie kidney, MDCK)，并用PEDV对转染后的MDCK细胞进行感染，结果证实了APN是PEDV感染细胞的一个受体。在APN与病毒结合区域的研究中，我国研究者单智夫对APN作为PEDV病毒受体的功能域进行初步鉴定，结果表明APN的受体功能域位置范围为第500-963位氨基酸。而后，孙东波的研究表明，PEDV的S蛋白第249-529位氨基酸区域是APN的一个潜在的结合区域。国内外的研究者通过对APN的基因结构和功能区域的研究是非常有价值的，这为APN阻断剂的研究提供了很好的理论基础。Sun D B等研究人员试图利用阻断病毒的结合区域的方式来阻断病毒与细胞的结合。 Meng F等人利用噬菌体肽库筛选的与APN结合的短肽能有效一直PEDV感染Vero细胞。尽管国内外的学者已经有了一些研究进展，但是APN作为PEDV病毒受体的作用机制仍没有得到完善地阐述，仍然是需要不断探索和研究的重要问题。PEDV的治疗目前还没有特效药，其治疗原则主要是防止继发感染。在防控方面，主要是严格按照免疫程序对生产母猪在产前40d和20d进行免疫接种，对断奶仔猪断奶10-15d进行免疫接种。所以对于APN的功能的研究是非常必要的，通过对APN的功能进行基础研究，不仅能够为阐述PEDV的作用机制提供理论基础，而且对于研发特效药物可以提供新的思路，从而减少我国甚至全世界养猪业的巨大经济损失。

2. 研究的基本内容和问题

目标：构建PEDV细胞受体基因真核表达质粒，转染ST细胞，验证细胞受体的表达情况，及对PEDV病毒复制的影响。

内容：构建PEDV细胞受体基因的真核表达质粒，对重组真核表达质粒进行基因和蛋白质鉴定，鉴定含有PEDV细胞受体基因的真核表达质粒是否能够成功构建，将成功构建的真核表达质粒转染ST细胞并观察含有PEDV细胞受体基因的真核表达质粒的表达情况。通过添加抑制APN蛋白酶活性的抑制剂研究APN对PEDV复制的影响。

拟解决的关键问题：

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3. 研究的方法与方案

研究方法及实验方案：

1、PCR扩增PEDV细胞受体基因；

2、构建PEDV细胞受体基因真核表达质粒；

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4. 研究创新点

1、不同于大多数对PEDV结构的研究，本课题选择PEDV的细胞受体基因进行对PEDV复制的研究。

2、本实验采用猪的睾丸细胞作为体外细胞培养，而不是常用的Vero细胞系。

5. 研究计划与进展

2020年1月—2020年3月，查阅文献，收集资料，撰写文献综述，设计引物。

2020年4月—2020年5月，扩增目的基因，构建含有目的基因片段的真核重组质粒，转染ST细胞，验证PEDV细胞受体基因的表达情况。

2020年5月—2020年6月，完成毕业论文的撰写。

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