1. 研究目的与意义
细菌的抗生素耐药性已经成为当今世界备受关注的公共卫生问题之一，对人类健康造成了极大的威胁。随着耐药细菌及多重耐药细菌的不断出现与抗生素的研发空白，使得新型抗菌药物的开发刻不容缓。而蛙来源的抗菌肽可以特异性地与细菌膜结合并形成孔洞，影响细菌膜完整性的同时干扰包括细菌多方面的生理进程。与传统的抗生素相比，这一特殊的抗菌机制使细菌很难对其产生耐药性。因而蛙来源的抗菌肽是新型抗菌药的可靠来源，也是解决抗生素耐药性问题的重要手段之一。
采用分子克隆技术从阔褶水蛙（Hylarana Latouchii）皮肤分泌物中提取的生物活性肽nigrocin-HL （肽序列为GLLSGILGAGKKIVCGLSGLC）经体外实验发现其具有一定的广谱抗菌活性，但其同时具有较强的溶血作用。本实验旨在体外、体内考察氨基酸序列修饰改造后的抗菌肽nigrocin-HLM（肽序列为GLLSGILGAGKKIVF-NH2）抗菌活性及毒性作用。
2. 文献综述
抗菌肽的研究进展和应用前景
【摘要】：
近年来，细菌的抗生素耐药性已经成为当今世界备受关注的公共卫生问题之一，对人类健康造成了极大的威胁。而作为解决抗生素耐药性问题的重要手段之一的抗菌肽日益受到广泛关注。国内外学者对各类抗菌肽进行了大量研究，并取得了一些成果。本文主要介绍对抗菌肽作用机制、研究现状及存在的问题。
3. 设计方案和技术路线
1、研究方案
1.1、体外抗菌试验
测定最小抑制浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）评估天然肽和设计肽的抗菌活性。受试菌株包括革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus (NCTC10788)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) (NCTC 12493);革兰氏阴性菌大肠杆菌Gram-negative bacteria Escherichia coli (NCTC 10418)和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853);酵母白色念珠菌yeast Candida albicans (NCYC 1467)。将菌株接种于Mueller-Hinton肉汤（MHB）培养基中，并在37℃恒温摇床培养箱（Stuart，UK）中孵育过夜。将菌液按比例与新鲜预热的MHB培养液混合并传代培养。根据菌液光密度判断细菌生长阶段，直至进入指数生长期（108菌落形成单位（CFU）/ ml）。最后用新鲜培养基稀释菌液至浓度为1105CFU / ml；将两种肽溶解于MHB配制5.12104μM的高浓度母液。随后将高浓度母液进行2倍连续稀释，96孔培养板每孔加入1μl不同浓度的肽和99μl稀释后的菌液，使肽终浓度为1μM到512μM，每个浓度设5个复孔。恒温孵育16小时后，用Synergy HT平板读数仪（Biotech，USA）在550nm处检测96孔板的吸光度。MIC即细菌无明显生长的肽的最低浓度；随后将孔中的10μl混合培养液加到Mueller-Hinton琼脂（MHA）培养基上，并在37℃恒温继续孵育18小时。MBC即未观察到菌落生长的肽最低浓度。一共进行三次独立实验。
4. 工作计划
第一阶段（2022.1.2-2022.3.8）：查阅文献，形成思路，制定研究方案；
第二阶段（2022.3.9-2022.3.30）：进行预实验，分析预实验结果；
5. 难点与创新点
1、 抗菌肽作为新型抗菌药物是研究热点。
2、 本文在阔褶水蛙提取的抗菌肽nigrocin-HL的基础上进行改造，得到新型抗菌肽nigrocin-HLM。
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