1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献） 水稻有两个栽培种，即亚洲栽培稻(Oryza Sativa L.)和非洲栽培稻(Oryzaglaberrima Steud.)。亚洲栽培稻分为籼稻(Oryza Sativa L.ssp.indica)和粳稻(O.SativaL .ssp.japonica)两个亚种，它们在产量、品质、抗逆性等方面各具特色，且其杂种F1具有强大的杂种优势[1]。由于杂交育种具有极大潜力，籼粳亚种间杂交优势利用是当前水稻育种的重要主攻方向[2]。但杂种F1的结实率偏低，一般为0～30%即不育性问题成为了限制其杂交优势利用的主要原因[3]。鉴于水稻籼粳杂交在水稻品种改良中有极高的应用价值，因此水稻亚种间杂种不育的遗传机理的不断深入研究具有重大意义。 生物在物种分化与物种形成过程中产生了多种生殖隔离机制，籼稻粳稻亚种间杂交不育性是合子后生殖隔离的一个例子[4-6]。Kato较早地报道了籼粳亚种间杂种F1存在不育或半不育现象。随后，研究者发现了一系列影响籼粳杂种F1不育的因素，包括雄配子败育、雌配子败育、花药开裂障碍、雌雄配子发育进程不一致、花粉在柱头上萌发障碍、配子发育受阻和环境条件的影响等，其中，雄配子败育(花粉败育)和雌配子败育(胚囊败育)是主要因素［7］。大多数学者认为，亚种间杂种F1的不育主要由主效基因控制，也受微效基因的修饰。Oka将栽培稻杂种不育的基因作用模式归纳为重复配子致死、单座位孢子体-配子体互作、单座位孢子体不育和互补孢子体不育4种模式[ 8]。水稻杂种不育由多个座位控制,包括控制雌性不育、花粉不育、以及配子体不育的基因座等，但人们对其分子遗传机理仍知之甚少。 籼粳杂种的遗传分析鉴定了大量的位点杂种不育性，有几个关于籼粳杂种不育的基因已经被克隆出来[9-11]，而其中S5是影响胚囊生育能力的水稻杂种不育的一个主要位点，它有三个等位基因，一个籼稻等位基因S5-i，一个粳稻等位基因S5-j，和一个中性等位基因S5-n。S5-i/S5-j基因型的杂种大多是不育的，而由S5-n或S5-i或S5-j组成的基因型杂种大多是可育的。1984年，日本的水稻育种家池桥宏认为籼粳亚种间杂种的不育性主要受第6染色体S5座位的等位基因控制。其中S5-n称为广亲和基因，并将水稻具有S5-n基因的品种称之为广亲和品种(WCVs,widecompatibility varieties)，它与籼稻和粳稻杂交的后代都表现比较正常的育性[12]。随着研究的深入，Yang等[13]对S5区域进行了重点研究，最终揭示了水稻籼粳亚种间存在生殖隔离的遗传机理。S5区域的遗传图谱已经构建完成，其覆盖多达五个开放阅读帧（ORF1到ORF5）。他们发现了该区域三个紧密连锁的基因：ORF3、ORF4和ORF5，这三者共同调控水稻亚种间杂交F1的育性。ORF5扮演“杀手”，ORF4起到辅助它的作用，而ORF3则功能相反，作为保护者存在。 与张启发院士课题组专注主要影响雌配子(胚囊)育性的S5基因不同，刘耀光教授团队针对水稻籼粳杂种雄性核不育基因进行了系统研究。张桂权等[14]对籼粳亚种间杂种的不育性进行了较系统的研究，认为籼粳亚种间F1的不育性至少由 6 个雄配子(花粉不育基因)影响。至今，已有Sa、Sb、Sc、Sd、Se[14]等被分子定位。在染色体1上定位克隆的Sa基因座影响水稻籼粳亚种间杂交一代的花粉育性，籼粳等位基因之间的相互作用导致携带粳型等位基因雄配子的特异性败育。水稻核不育基因方面已发现的多数杂种不育的座位(包括Sa)其遗传表现符合单座位等位基因相互作用模型(one-locusallelic interaction model)，Sa实际上是由SaM和SaF两个相邻的基因组成的复杂座位。提出了“两基因/三元件互作模型”(two-gene/three-component interaction model)：SaM ,SaM-和SaF 中缺少任一组件时，将不会产生杂种雄性不育。很好解释了籼粳稻之间的杂种雄性不育。而SaF 与SaM 的互作抑制可能是避免籼稻品种(单倍型为SaM SaF )雄性不育的一个重要机制。在籼稻中也发现了一些具有 |
| SaM SaF-单倍型的品种，它们和粳稻或籼稻的杂种中缺乏SaM-或SaF ，因而是可育的。因此SaM SaF-可以被定义为亲和性的座位，即Sa-n。因此Sa-n(SaM SaF-)、Sa-i(SaM SaF )和Sa-j(SaM-SaF-)就和S5座位类似，形成了一个控制水稻杂种雄性不育和可育(亲和)的三等位基因系统［15］。这在一定程度上对水稻杂交不育的分子机理提供了统一的模式基础。 Yu等[16]创造性地运用自私基因模型进一步揭示了水稻杂种不育性的分子机制。万建民团队对南方野生稻品种O.meridionalis accession 82031(Mer)和普通野生稻粳稻品种O.Sativa ssp.japonica,Dianjingyou1 (DJY1)回交F1群体进行了数量性状位点（QTL）分析，检测到四个主要控制杂交雄性不育的数量性状位点，其中，qHMS7位于几个先前确定的QTLs附近，说明qHMS7是一个非常重要的杂种不育位点。对qHMS7位点的精细定位最终其被限定在31.6-kb的区间内，测序分析鉴定出qHMS7基因座区域的三个基因在DJY1（ORF1D，ORF2D和ORF3）中，但只有两个基因在Mer（ORF1M和ORF2M）中。ORF1基因编码一个未知功能的蛋白；ORF2基因编码一个杀配子的毒性蛋白，以母体效应导致花粉死亡；而ORF3基因编码一个解毒蛋白，以配子体效应保护配子，使携带ORF3基因的花粉可育。 迄今为止, 水稻中还有Sc, S1, S7, HSA1, DPL1/DPL2, S27/S28等被图位克隆 [17~18,19,20~22,23~24,25,26]。 水稻亚种间杂种不育的调控机制广泛，内容复杂，目前对其并未了解透彻。本研究中，我们对一个低育材料进行了杂种不育原因的初步探究，并对该不育位点进行了定位，以期更详细全面地了解水稻亚种间杂种不育发育的分子机制，为未来在杂交水稻育种生产中提供理论基础和基因资源。 参考文献： [1]杨守仁，沈锡英，顾慰莲，等.籼粳杂交育种研究[ J] .作物学报，1962，2：97～102 [2]袁隆平. 杂交水稻的育种战略设想[ J] .杂交水稻， 1987，1：1～3 [3]杨守仁，沈锡英，顾慰莲，等. 籼粳杂交育种研究.遗传学通讯，1973，2：34～38 [4] Liu K，Zhou Z，XuC，Zhang Q，Maroof, MAS.An analysis of hybrid sterilityin rice using a diallel cross of 21 parents involving indica, japonica andwide compatibility varieties[J]. Euphytica，1996，90（3）：275～280 [5] Ouyang Y ，Liu Y G， Zhang Q. Hybrid sterility in plant: Stories from rice[J]. Curr Opin PlantBiol，2010，13（2）：186 [6]Ouyang Y D ，Chen J J，DingJ H， Zhang Q F.Advances in theunderstanding of inter-subspecific hybrid sterility and wide-compatibility inrice[J].Chin Sci Bull，2009,54（14）：2332～2341 [7]李晓玲. 水稻籼粳亚种间杂种不育性的研究进展[J].中国农学通报，2004，20(5):45～49 [8]Oka HI.Phylogenetic differentiation of cultivated rice. VI. The mechanism ofsterility in the inter varietial hybrid［J]．Jpn. J.Breed. ，1953，2(4):217～224 [9]Chen J J，et al. A triallelic system of S5 is a majorregulator of the reproductive barrier and compatibility of indica-japonicahybrids in rice[J].Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，2008，105(32)： 11436-11441 [10]Long Y M，et al.Hybrid male sterility in ricecontrolled by interaction between divergent alleles of two adjacent genes[J].Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，2008，105(48)：18871-18876 [11]Mizuta Y，Harushima Y，KurataN.Rice pollen hybrid incompatibility caused by reciprocal gene loss
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| ofduplicated genes[J].Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，2010，107(47)20417-20422 [12]Ikehashi H，Araki H.Variety screening of compatibilitytypes revealed in F1 fertility of distant cross in rice[J]. Jpn.J. Breed.，1984，34(3): 304-313 [13] Yang J Y，Zhao X B，ChengK，et al．A killer－protectorsystem regulates both hybrid sterility and segregation distortion inrice[J].Science，2012，337 (6100):1336-1340 [14]张桂权，卢永根. 栽培稻杂种不育性的遗传基础[J].华南农业大学学报，1987，8(3):53－62 [15]Long Y M，Zhao L F，NiuB X，et al.Hybrid male sterility inrice controlled by interaction between divergent alleles of two adjacent genes[J].Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A.，2008，105(48):18871－18876 [16]Yu X W，et al.A selfish genetic element confersnon-Mendelian inheritance in rice[J].Science，2018，360（6393）：1130-1132 [17]张泽民. 栽培稻杂种不育基因座位的精细定位及分子标记辅助选择[D].广州：华南农业大学，1999 [18]杨存义，陈忠正，庄楚雄，等. 水稻籼粳杂种不育基因座 S-c的遗传图和物理图精细定位[J]． 科学通报，2004，49（13）：1273-1277 [19]Shen R X, WangL, Liu X P,et al.Genomic structural variation-mediated allelic suppressioncauses hybrid male sterility in rice[J].NATURE COMMUNICATIONS, 2017, 8(1310) [20]马生健.栽培稻种间杂种不育基因 S1 的克隆与功能分析[D].广州:华南农业大学，2009 [21] Xie Y Y, Xu P, Huang J L,et al.Interspecific Hybrid Sterility in RiceIs Mediated by OgTPR1 at the S1 Locus Encoding a Peptidase-likeProtein[J].MOLECULAR PLANT, 2017, 10(8):1137-1140 [22] Yu Y, Zhao Z, Shi Y, et al. Hybrid sterility in rice (Oryza sativaL.) involves the tetratricopeptide repeat domain containing protein.Genetics,2016, 203: 1439–1451 [23] 田华.水稻籼粳亚种间杂种胚囊不育基因 S7 的精细定位及细胞学研究[D].南京:南京农业大学，2009 [24] 石彦荣.水稻杂种雌配子不育的细胞学研究和 S 7 基因的定位[D]．南京南京农业大学，2010 [25] Kubo T, Takashi T, Ashikari M, et al. Two tightly linked genes at thehsa1 locus cause both F 1 and F 2 hybrid sterility in rice. Mol Plant,2016,9: 221–232 [26]Kitamura E.Genetics studies on sterility observed in hybrids between distantly relatedvarieties of rice, Oryza sativa L. Bull Chugoku Agricult Exp Stat Ser A,1962, 8: 141–205
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2. 研究的基本内容和问题
| 研究的目标、内容和拟解决的关键问题 （一）工作目标 亚洲栽培稻的籼稻和粳稻两个亚种，其杂种F1具有强大的杂种优势，但杂种F1的结实率偏低，杂种不育成为了限制其杂交优势利用的主要原因。鉴于水稻籼粳杂交在水稻品种改良中有极高的应用价值。因此我们试图定位一个水稻亚种间杂种不育的位点，并探究其遗传机理。 （二）研究内容 利用PA64s与CSSL155的F2群体，通过开发SSR，Indel等分子标记，将导致水稻亚种间杂种不育的位点进行全基因组定位。先使用10个极端个体进行初连锁，在发现疑似位点之后再增加极端并加密标记，进一步精细定位，缩小区间。 （三）拟解决的关键问题 1. PA64s与9311都属于亚洲栽培稻中的籼稻亚种，开发有多态性的分子标记并不容易。目前我们利用将PA64s与9311进行重测序利用有差异的位点进行设计引物。 2. PA64s/CSSL155的育性在高温环境下表现为半不育，但在低温环境下表现为高育，我们利用PA64s/CSSL155的F2群体对B基因进行全基因组定位，由于是全基因组的F2群体，每个单株之间生育期差异较大，有部分抽穗期靠后的单株可能在其抽穗时经历低温，使其半不育表型恢复为高育，这对我们的定位工作有一定的影响。 3. PA64s本身携带有一个光温敏雄性不育基因，是位于十二号染色体上的pms3，由于它的存在，F2群体中会有一部分单株表现为类似PA64s的完全不育的表型，但是由于在群体中容易串粉，最终单株表现为低育甚至接近半不育的表型，对我们定位也会产生影响。我们采用田间观察表型，取花粉镜检，并结合分子标记，剔除在pms3位点是PA64s纯合的单株。
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3. 研究的方法与方案
| 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 （一）研究材料 以PA64s为母本，与9311配制杂交组合，随后以9311为轮回亲本分别在南京和海南两地连续回交，经8年时间构建156个家系的置换系群体。 （二）研究方法 1、细胞学研究 （1）表型观察：南京正季于土桥实验基地将品种9311、PA64s、置换系群体及其与PA64s的后代种植于田间。观察挑选F2群体中分离的低育植株，每株取3穗用于统计结实率及提取DNA。 （2）花粉育性调查：用I2-KI染色法，根据花粉染色及形态判断其育性。 每个单株选取1个已抽出约1/3的主茎穗或较大分蘖穗，选取当天要开放的上部颖花（3个）保存在卡诺溶液中；镜检时，用1% I2-KI液染色、压片，观察花粉是否败育。 （3）制作花药的半薄切片，观察花药发育各时期的特征，了解其败育的机理。 （4）极端个体单株编号取样，提取DNA，进行SSR分子标记分析，连锁定位 2、遗传与基因定位研究 （1） 亲本间多态性分析：在拔节前后，采集亲本叶片，筛选具有多态性的SSR标记。 （2） 极端个体单株编号取样，提取DNA，进行SSR分子标记分析，连锁初定位。 （三）技术路线 分别考察CSSL，CSSL/9311，PA64s/CSSL结实率，发现一个结实率下降最多并最稳定的家系CSSL155。我们利用CSSL155作为研究对象开展接下来的实验。利用PA64s与CSSL155的F2群体，通过开发SSR，Indel等分子标记，将导致水稻亚种间杂种不育的位点进行全基因组定位。先使用10个极端个体进行初连锁，在发现疑似位点之后再增加极端并加密标记，进一步精细定位，缩小区间。 （四）实验方案 利用PA64s与CSSL155的F2群体，通过开发SSR，Indel等分子标记，将导致水稻亚种间杂种不育的位点进行全基因组定位。先使用10个极端个体进行初连锁，在发现疑似位点之后再增加极端并加密标记，进一步精细定位，缩小区间。 （五）可行性分析 原有研究基础：从1999年，以PA64s为母本，与9311配制杂交组合，随后以9311为轮回亲本分别在南京和海南两地连续回交，经8年时间构建156个家系的置换系群体。经过多年观察研究发现，其中一个置换系群体CSSL155的低育性状表现稳定。实验室具有技术和资源支持后续的深入研究。 |
4. 研究创新点
| 特色或创新之处 由于CSSL155本身结实率正常，PA64s/CSSL155结实率显著下降，说明在CSSL155中来自PA64s纯合的插入片段控制了一个影响结实率的位点，且存在一个位点杂合降低结实率的位点。我们通过全基因组连锁及QTL分析在chr.7发现了PA64s纯合降低结实率的位点，并通过遗传分析确定了该位点对另一个杂种不育位点上位性控制。本研究与其他关于杂种不育位点的研究不同，水稻中还没有关于对杂种不育基因上位性控制的报道。如果能够精细定位并进一步克隆该上位性基因，将会对杂种不育的理论研究及实践利用提供重要的基础。
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5. 研究计划与进展
| 研究计划及预期进展 1）2018年7月—2018年10月，对F2群体取极端叶片定位，熟悉水稻田间管理的方法，了解水稻的生长特性，学习实验室器材的使用、各项实验技术。 2）2018年11月—2019年1月，对群体定位以及学习各种细胞学实验技术、置换系群体后代进行精细定位，分时期取样对极端个体分别进行细胞学观察。 |
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