1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
水稻是我国主要的粮食作物，提高水稻产量以满足日益增长的粮食需求是一个巨大的挑战，利用杂种优势进行杂交水稻育种是大幅度提高作物产量的重要而有效的途径。而杂交水稻的生产以及杂种优势的利用依赖于雄性不育材料的发掘和利用，因此对水稻雄性不育的研究具有十分重要的意义。水稻除了具有重要的农业价值外，还是单子叶模式植物。因此，对水稻雄性生殖发育的研究具有重要的应用价值和科学意义[1]。雄性不育的主要类型可分为：核质互作型雄性不育和细胞核雄性不育，核质互作型雄性不育由核基因和胞质基因共同作用所决定。水稻的核质互作不育其按照恢复系和保持系的不同，可分为野败型(WA)、包台型(BT)、滇型(DY)和红莲型(HL)；按照不育资源可分为普通野生稻型、非洲栽培稻型、籼稻型和粳稻型等；按花粉败育又可分为无花粉型、典败型、圆败型和染败型。细胞核雄性不育是由核基因控制的雄性不育，主要包括单基因显性核不育、单基因隐性核不育和双基因隐性核不育, 此外还有其他类型，如光温敏型核不育。
1964年袁隆平发现水稻雄性不育株，从而开始了我国水稻雄性不育系的应用研究。1970年冬李必湖等发现野生稻花粉败育株, 为水稻雄性不育研究打开了突破口[2]。1973年，利用“三系配套”技术育成优良杂交水稻组合，宣告我国第1代杂交水稻培育成功[3]。1973年，石明松发现农垦58S材料[4]，通过选育一系两用的光温敏不育系，使培育两系法杂交水稻成为可能，第2代杂交水稻进一步推动了杂交水稻的发展。由于自然条件下发生的突变率低，一般低于0.1，突变体数量少，不能满足生产和研究应用。人们利用物理化学诱变使突变率达到3，包括快中子轰击和通过化学诱变剂甲基磺酸乙酯处理植物的种子，然后根据处理后的植株的形态变化或对生物和非生物逆境筛选突变体。为了更有效地大规模的创制突变体，通过T-DNA插入法，用农杆菌介导法对水稻实现遗传转化，成功地将目标DNA片段整合到植物染色体上；以及转座子法，转座子是染色体上一段可移动的DNA，它可以通过切割、重新整合等一系列过程从染色体上的一个位置转移到另一个位置。转座插入突变位点随着转座子的转座，基因活性得以恢复，以此来确定表型突变是否由转座插入突变引起，同时，由于转座子的不断转座，故只需少量转化子就可产生大量的突变。随着现代遗传工程技术日趋完善，获得了大量的突变体材料，为发掘不育基因创造水稻雄性不育资源提供必要条件。
引起水稻雄性不育的生理生化基础有很多，从植物生长物质方面：雄性不育是由于水稻雄性不育发生过程中生长物质生长素、赤霉素和多胺发生亏损，乙烯过量产生，脱落酸含量显著减少导致的，从物质及能量代谢系统方面：雄性不育的发生有可能与ATP的含量以及线粒体的状态、淀粉、蛋白质、氨基酸的变化有关，并且花粉的正常发育与花粉中酶活性有关等，其中环境因子引起的雄性不育，被称为生理上的雄性不育，此类雄性不育通常由当代胁迫所造成，不育性状不能传递给子代；而基因突变引起的雄性不育，被称为遗传上的雄性不育，是受到突变的雄性不育基因主导控制的，不育性状可稳定传递给子代。
2. 研究的基本内容和问题
利用雄性不育系来生产杂交种，不仅可以省去人工去雄的大量人力和时间，简化制种步骤，降低杂种种子生产成本，还可避免人工去雄由于操作创伤而降低结实率和由于去雄不及时、不彻底或天然杂交率不高而混有部分假杂种，从而影响杂种种子纯度和产量，在生产上，如果不育系的自交结实现象严重，就会降低杂交种子的纯度，造成杂交稻产量的下降。因而不育系的自交结实、败育不彻底，一直是杂交稻“三系”繁殖和制种工作中的一个重要课题。水稻雄性生殖发育在开花植物的有性生殖的重要过程，在该过程任何发育阶段出现异常均可能导致雄性不育。因此对花药发育的深入理解有助于解决这些生产上的问题。尽管在模式生物中,很多参与花药发育过程中的基因已经被成功克隆,然而对于它们的研究水平大部分停留在分析单个基因的功能上，对已知基因产物的分子机理和生化互做的基础研究还不清楚，因此解释花药发育机制还需要更多的研究。
本研究利用EMS诱变得到宁粳四号不育突变体和N22杂交后构建了F2分离群体，挑选其中10株隐性极端个体进行连锁分析，初步将不育基因限定在第1号染色体短臂N1-11以及N1-17之间。随后又利用3600株F2群体最终将不育基因精细定位到O1-20和QI-25标记之间，物理距离为120kb。进一步分析发现，该片段存在定位区间内包括了10个开放阅读框（ORF），没有已克隆的雄性不育基因，其中有一个ORF的表达模式符合不育突变体的表型特征，在花药中特异性高表达，相应载体构建以及互补试验正在进行中。并利用水稻雄性不育突变体及野生型做醋酸洋红染色、半薄切片等细胞学实验，并通过实时荧光定量PCR实验对基因在不同组织中的表达量进行初步分析。
本研究拟解决的关键问题为通过图位克隆的方法，初定位目的基因。再通过开发一系列的SSR标记，缩小定位区间，锁定基因的位置。然后利用基因预测的方法对候选基因进行测序，确定突变的基因以及基因突变的位点和类型等。3. 研究的方法与方案
研究方法：
1. 使用CTAB法抽提叶片基因组DNA，将提取出的DNA用ddH2O溶解，作为母液储存在4℃冰箱。
2. 连锁定位时将母液稀释5倍成为工作液作为PCR的扩增模板，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对扩增产物进行检测，凝胶显色时采用银染实验。
4. 研究创新点
本研究通过对一个雄性不育突变体的不育基因精细定位，将基因限定到120kb范围内，该区间没有报道已克隆的雄性不育基因，可以得知该不育基因应该是一个新基因。
通过对该突变体的细胞学研究寻找导致该突变体雄性不育的原因。
对区间内基因分析，并且对可能的目的基因构建了干扰载体，为该不育基因最终克隆及分子机理研究奠定了基础。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
1. 2019年1月，学习实验基本操作和实验器材使用，醋酸洋红染色法观察花粉形态结构，学习利用荧光实时定量PCR仪进行基因表达量分析。
2. 2019年3月-4月，学习半薄切片技术观察花药发育,转基因侵染过程等。
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