1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
本课题的意义 植物在生长发育过程中遭遇到各种病原物的侵染时,其自身R基因(抗性基因,resistancegenes)编码的蛋白能特异性地识别病原物,激发抗病信号的产生,抗病信号经过下游途径的一系列环节的传递,最终引起植物的抗病反应[1-3]。SGT1(SKP1等位基因G2的抑制子,与着丝粒装配和泛素化有关)是由酵母中鉴定出的基因,与泛素化和着丝粒的装配等有关,被发现其在多种植物抗病反应的下有信号传递途径起重要的调控作用,并且SGT1的过量表达也可以提高植物的抗病性[4-8]。番茄抗性基因Sw5b编码的蛋白具有核苷酸结合位点和亮氨酸重复富集(NB-LRR),番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus)TSWV编码的NSm是与之对应的无毒基因[9-10]。鉴定在NSm激发Sw5b介导的针对TSWV的抗性过程中是否依赖SGT1基因,对进一步了解Sw5b介导的抗病机制以及奠定了基础,并为针对TSWV的抗病工程提供理论依据。 国内外研究概况 SGT1在植物R基因介导的抗病毒反应中发挥重要作用,抗性基因Rx基因能够降低马铃薯病毒X(potatovirusX,PVX)在宿主植物体内的积累。利用病毒诱导的基因沉默体系VIGS(virusinducedgenesilencing)沉默烟草SGT1基因,结果表明宿主植物对PVX的抗性丧失,究其原因是Rx基因的表达几乎消失[6]。在其他病毒侵染宿主植物的过程中也发现类似的现象,并且SGT1在抗真菌、细菌和线虫等方面也具有重要作用。对SGT1进行序列分析可知,其具有5个保守区域,分别是TPR(tetratricopeptiderepeat)、VR1(variableregion1)、CS(CHORDandSGT1)、VR2(variableregion2)、SGS(SGT1-special),分别可与植物的蛋白互作,共同发挥抗病作用[4]。CS与RAR1互作,激活SCF与COP90的复合体;TPR、CS与Hsp90互作,形成复合体,改变R蛋白的构象,调节抗病途径中其他的蛋白复合体;TPR、CS可与SKP1互作,进而调节泛素化[11]。SGT1基因作用模式:SGT1在R基因编码产物识别病原物无毒基因产物以前,与RAR1、HSP90共同对R蛋白复合体的装配进行调控,维持在一定的积累水平,在识别无毒基因产物后,SGT1通过与SCF、CSN和RAR1等的互作,泛素化降解某些蛋白因子,激活下游抗病信号传导[12-14]。近期的研究表明SGT1不仅参与了调控R基因介导的抗病反应,而且还可能与广谱抗性反应的调控有关。 | |
应用前景 利用病毒诱导基因沉默(VIGS)体系,鉴定在NSm激发Sw5b介导的针对TSWV的抗性过程中是否依赖SGT1基因(SKP1等位基因G2的抑制子,与着丝粒装配和泛素化有关),验证病毒诱导沉默体系在研究宿主植物抗TSWV下游途径相关基因鉴定方面的可行性,为进一步揭示广谱抗病反应的分子机制提供了一定的证据,并为植物针对病毒的抗病基因工程的应用提供了更多的选择。 | |
参考文献 1.HammondKosackKE,JonesJDG.Plantdiseaseresistancegenes.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol,1997,48:575-607 2.JonesJD,DanglJL.Theplantimmunesystem.Nature,2006,444:323-329 3.DanglJL,JonesJDG.Plantpathogensandintegrateddefenceresponsestoinfection.Nature,2001,411:826-833 4.AzevedoC,SadanandomA,KitagawaK,etal.TheRAR1interactorSGT1,anessentialcomponentofRgenetriggereddiseaseresistance.Science,2002,295:2073-2076 5.TrM,GordonP,CuzickA,etal.ArabidopsisSGT1bisrequiredfordefensesignalingconferredbyseveraldownymildewresistancegenes.PlantCell,2002,14:993-1003 6.PeartJR,LuR,SadanandomA,etal.UbiquitinligaseassociatedproteinSGT1isrequiredforhostandnonhostdiseaseresistanceinplants.ProcNatlAcadSciUSA,2002,99:10865-108694. 7.ChenY,LiHK,ChenCJ,ZhouMG.SensitivityofFusariumgraminearumtoFungicideJS399-19:InvitroDeterminationofBaselineSensitivityandtheRiskofDevelopingFungicideResistance[J].Phytoparasitica,2008,36(4):326-337. 8.AzevedoC,BetsuyakuS.RoleofSGT1inresistanceproteinaccumulationinplantimmunity.EMBOJ,2006,25:2007-2016 9.BrommonschenkelS.andTanksleyS.Map-basedcloningofthetomatogenomicregionthatspanstheSw-5tospovirusresistancegeneintomato.Mol.Gen.Genet.1997,256:121126. 10.MarianaI.Spassova,TheoW.Prins1,RolfT.Folkertsma1,etal.ThetomatogeneSw5isamemberofthecoiledcoil,nucleotidebinding,leucine-richrepeatclassofplantresistancegenesandconfersresistancetoTSWVintobacco.Mol.Breed.,2001,7:151161. 11.KitagawaK,SkowyraD,ElledgeSJ,etal.SGT1encodesanessentialcomponentoftheyeastkinetochoreassemblypathwayandanovelsubunitoftheSCFubiquitinligasecomplex.MolCell,1999,4:21-33. 12.ShirasuK,SchulzeLefertP.Complexformation,promiscuity,andmultifunctionality:proteininteractionsindiseaseresistancepathways.TrendsPlantSci,2003,8:252-258. 13.TakahashiA,CasaiaC.HSP90interactswithRARLandSGT1andisessentialforRPS2-mediateddiseseresistanceinArabidopsis.ProcNatlAcadSciUSA,2003,100:11777-11782. 14.LiuY,Burch2SmithT,SchiffM,etal.MolecularchaperoneHSP90associateswithresistanceproteinNanditssignalingproteinSGT1andRAR1tomodulateaninnateimmuneresponseinplant.JBiolChem,2004,279:2101-2108. |
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
构建诱导基因沉默的载体pTRV2-SGT1,验证病毒诱导沉默体系在研究宿主植物抗TSWV下游途径相关基因的可行性,证明NSm激发Sw5b介导的针对TSWV的抗性是否依赖于SGT1。
研究内容
3. 研究的方法与方案
研究方法
提取植物总RNA、反转录、PCR、酶切、琼脂糖胶回收、载体构建、转化大肠杆菌、转化农杆菌、农杆菌注射等。
技术路线
4. 研究创新点
特色或创新之处
以热点抗性基因Sw5b为材料,以病毒诱导沉默的手段敲除SGT1基因,解释其在Sw5b介导的抗病毒反应方面的作用。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
(1)2014.62014.7提取本氏烟总RNA并反转录得到cDNA。
(2)2014.82014.9构建pTRV2-SGT1载体。
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