1. 研究目的与意义
内容：当前，高通量筛选(HTS)和高内涵筛选(HCS)已广泛应用于药物的研究和开发，如将基于蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP 1B)调控序列的高通量药物筛选模型用于抗糖尿病药物的筛选等。通过构建基于mPGES-1基因调控或酶蛋白活性的高通量药物筛选模型，从动植物、微生物来源物或合成化合物中筛选选择性抑制mPGES-1表达或酶活性的活性物质，进一步开发成新型抗炎药物，有望避开传统NSAIDs和特异性COX-2抑制剂的副作用。在此背景下，探究新型mPGES-1抑制剂（吡咯结构抑制剂或苯丙异喹啉结构抑制剂）的合成与结构确证，整理数据，得出结论，撰写论文。
意义: 由于mPGES-1在许多疾病如炎症及其相关性发热、动脉粥样硬化及癌症等的病理生理中发挥着重要作用，特别是参与关节炎的病理过程，故其有可能成为一个前景良好的、预防或治疗关节炎及有关疾病的药物靶点。
2. 文献综述
新型mPGES-1抑制剂的研究与前景
李衍飞
摘要：综述膜结合型前列腺素E2合酶-1(mPGES-1)的生物学性质、生理和病理作用,以及将其作为一个新的药物作用靶点用于药物开发的可能性。mPGES-1是3种前列腺素E2合酶之一,属于诱导型表达的酶,能被致炎因子诱导而大量表达,在多种疾病,如关节炎、炎症相关性发热和疼痛、动脉粥样硬化及癌症的病理生理过程中均发挥着重要作用。及探索新的靶点药物和NPGES-1的抑制剂。
关键词：膜结合型前列腺素E2合酶-1；病理生理作用;药物靶点
前列腺素类化合物(prostanoid, PGs)是一类在体内广泛存在的脂类调节因子,包括前列腺素和血栓烷(TXA2),其中前列腺素E2(PGE2)是最为常见和重要的物质。一方面, PGE2对胃肠黏膜有营养、修复和保护作用,可防止溃疡的形成;另一方面,PGE2也是炎症反应中疼痛和发热的介质,参与炎症的病理生理过程[1],同时还与骨质破坏和癌症的发生及发展有关[2, 3]。PGE2的生物合成受3种酶的顺序调控,首先是细胞膜上的磷脂在磷脂酶A2(phos-pholipase A2,PLA2)的作用下,释放花生四烯酸(arachidonic acid,AA);而后,花生四烯酸被环氧化酶(Cyclooxygenase, COX)催化形成前列腺素G2(PGG2)和前列腺素H2(PGH2); PGH2再被前列腺素E2合酶(PGES)催化产生PGE2。COX主要有两种: COX-1和COX-2。COX-1是组成型酶,表达于几乎所有组织中。COX-2为诱导型酶,在炎症反应细胞如成纤维细胞、巨噬细胞和滑膜细胞中大量表达,促进PGE2的大量生成而参与炎症反应[4]。目前治疗炎症的一大类药物非甾体抗炎免疫药(NSAIDs)就是针对COX起作用的。NSAIDs可分为两类:非特异性NSAIDs和特异性COX-2抑制剂,特异性COX-2抑制剂减轻了COX-1被抑制引起的胃肠道等不良反应,在世界范围内获得了广泛的应用。但近年来,特异性环氧化酶(COX)-2抑制剂(如Rofecoxib、valdecoxib)因其副作用(引起肾脏的不良反应,增加心血管疾病的发病和导致血栓形成的危险)而相继从市场撤回,引起社会对此类抗炎药物的极大关注[5，6]。正是由于特异性COX-2抑制剂的安全性问题,使得研究者转而将新药开发的目光投向直接靶向PGE2合成的酶系-PGES的药物上。
前列腺素E2合酶(PGES)是 PGE2生物合成过程的末端限速酶,催化COX的产物PGH2转化成PGE2。目前为止,根据PGES在细胞中的定位和对谷胱甘肽(GSH)的依赖性, PGES至少可分为三种:胞质型前列腺素E2合酶(cPGES)、膜结合型前列腺素E2合酶-1(mPGES-1)和膜结合型前列腺素E2合酶-2(mPGES-2)[7]。其中,与其他两种酶不同的是, mPGES-1是诱导型表达的酶,参与到炎症等多种疾病的病理生理过程中[8-10]。
1mPGES-1
人们最早从牛和羊的精囊腺中得到部分纯化的mPGES-1。1999年Jakobsson等[11]发现人的mPGES-1具有明显的PGES活性,并将其定义为MGST-L1(mi-crosomalglutathione S-transferase 1-like 1)。后来由于它存在于微粒体而将其命名为mPGES,随着mPGES2的发现,它又被命名为mPGES-1。mPGES-1属于MAPEG(membrane-associatedproteins involved in eicosnoid and glutathione metabolism)超家族,家族成员还包括微粒体谷胱甘肽转移酶-1(microsomal glu-tathionetransferase-1 ,MGST-1), MGST-2,MGST-3,5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)和白三烯C4合成酶(LTCS)。
1.1mPGES-1的蛋白结构及酶特性 mPGES-1存在于核膜和微粒体膜,分子量大约为16 kD,约含153个氨基酸;大鼠和小鼠的mPGES-1蛋白分别有79%和80%与人的mPGES-1相同,而大鼠和小鼠的mPGES-1蛋白则有94%的同源性。mPGES-1催化PGE2生成时需要GSH作为必要的辅助因子,mPGES-1活性在体外可被COX-2的抑制剂NS-398所抑制,另外mPGES-1活性还可被FLAP的抑制物MK-886强烈抑制。在FLAP上与MK-886结合所必需的区域(同样与AA相结合)高度保守地存在于LTCS和mPGES-1,提示这3种蛋白上可能存在相同的与类花生酸类物质相结合的区域[12]。
1.2mPGES-1的基因结构与转录调节 人的mPGES-1基因位于9q34.3,基因大约长15 kb,含3个外含显子;它的启动子富含GC,存在几个可能的转录因子结合位点,包括2个GC盒、2个Tandem Barbie盒和1个AHR(argl hydrocarbonresponse element),但没有TATA盒在其功能位点[13]。和COX-2不同,在mPGES-1基因mRNA的3.端没有AUUUA不稳定序列;鼠的mPGES-1基因与人的相似,长约10 kb,也含3个外显子(174,80和567 bp)。通过对小鼠基因上游1800 bp片段的分析显示,其上游含C/EBPA,C/EBPB和AP-1的结合位点、2个串联的GC盒、3个糖皮质激素受体应答元件和2个Progesterone受体[14]。对MC3T3-E1和RAW264.7细胞的启动子研究发现,位于转录起点-700 bp到-1 814 bp之间区域的C/EBPA、B和AP-1不是mPGES-1转录所必需,在-150 bp到-700bp之间的区域则可能存在负调控元件,而两个串联的GC盒为mPGES-1转录所必需,对人mPGES-1上GC盒的研究也得到同样结果。与GC盒结合的转录因子是Egr-1 (early growthresponse-1),Egr-1含3个锌指结构,通过与富含GC的序列5.-GCG(T/G)GGGCG-3.结合调节转录。在TNF-A或(和)IL-1B的诱导下,Egr-1与mPGES-1启动子上接近转录起点的近端GC盒结合从而启动转录[15]。而Ekstrom等[16]认为人的mPGES-1表达受到SP1和SP3的调节。另外,在A549细胞中,NF-B的抑制物IBAvN能抑制IL-1B诱导的mPGES-1表达[17],提示NF-B可能在IL-1B诱导的mPGES-1的转录中起重要作用,但NF-B结合位点在mPGES-1启动子上的定位还有待研究。多条信号转导通道参与mPGES-1的表达,在PCCL3细胞中RET/PTC通过Shc-RAS-MEK-ERK信号途径诱导mPGES-1的表达[18];而Kotha等[19]研究发现,TNFA通过PC-PLC-PKC-NO-cGMP-PKG信号转导途径诱导mPGES-1的表达。
1.3mPGES-1的表达与功能 研究已表明PGE2的生物合成存在瞬时和延迟2种不同的反应,前者在受到刺激信号后数分钟内发生,而后者在受到诱导后数小时或十几小时才发生。COX-1参与瞬时的PGE2生物合成,而延迟的PGE2生物合成则由COX-2介导。当mPGES-1和COX-2共转染HEK293细胞时,无论是内源或外源的AA都会导致大量PGE2的产生;而当mPGES-1和COX-1共转染时,只有在高浓度的外源AA存在或内源cPLA2突然大量激活,才会观察到PGE2的产生。这说明mPGES-1合成PGE2主要是通过依赖于COX-2的途径,即mPGES-1和COX-2一起组成PGE2生成途径。但也有研究表明mPGES-1影响依赖于COX-1的PGE2基础表达,mPGES-1缺失的小鼠胃和脾的PGE2基础表达下降80%~90%,在脑和肾脏则下降50%[20]。免疫化学分析表明mPGES-1和COX-2都是分布在细胞核周的膜上[3,13],这两种酶共存于同一亚细胞部位将会使PGH2有效地转化。但为何mPGES-1选择与COX-2而非COX-1一起协同作用合成PGE2,其中的机制还有待人们进一步研究。研究表明mPGES-1和COX-2均为诱导酶,它在正常组织中的基础表达非常低,但受到致炎因子如TNFA,IL-1B等的刺激时,mPGES-1在各种组织例如大脑、肺、脾、胃、肾脏和精囊中的表达急剧上升[12,20]。大鼠体内的mPGES-1在致炎的条件下如LPS刺激所致的发热或佐剂诱导的关节炎时表达上调[5]。在各种培养细胞中,当受到各种致炎因子刺激时也会导致mPGES-1的表达上升,同时伴随着COX-2表达的上调,导致PGE2产量的大幅增加[12,21]。而受到地塞米松的作用时,mPGES-1和COX-2的表达和PGE2的产生同时回到基础水平。需要指出的是,mPGES-1和COX-2诱导的动力学存在不同之处,说明它们的调节机制是不同的[22]。
1.4mPGES-1在生理及病理过程的作用 研究表明COX-2参与人的多种疾病,包括炎症、疼痛、发热、肿瘤和阿尔茨默病等。由于和COX-2及PGE2的关系,mPGES-1同样参与多种病理生理过程。
选择性COX-2抑制剂像塞来昔布1（IC50=22μM），罗美昔布2（IC50=33μM），伐地昔布3（IC50=75μM）以及NS-398（IC50=20μM)等
随后的研究都着眼于选择性抑制剂的开发，有研究者通过建立细胞模型筛选出具有选择性抑制mPGES-1活性的化合物CMl88；从有生物或药用活性的化合物库中，通过高通量筛选也发现了一些mPGES-1选择性抑制剂，如具有咪唑菲结构的化合物MF63、苯唑西林和二羟丙茶碱等，这些抑制剂具有较低的半数抑制浓度和较高的生物利用度。此外，还有一些新的筛选方法也在不断发展。
最近，匹立尼酸衍生物被开发成新型mPGES-1和5-LOX 酶双重抑制剂，在这一系列化合物中，联苯匹立尼酸衍生物分子中有一个亲脂性正己基链，一个羧基，它表现出mPGES-1和5-LOX抑制活性( mPGES-1 IC50=1.3μmol/L;5-LOXIC50=1.0μmol/L)，同时带有一定的COX抑制活性。联苯昔康衍生物表现出了高效的mPGES-1抑制活性和相对较弱的COX抑制活性（mPGES-1 IC50=0.016μmol/L;COX-1IC50=118μmol/L，COX-2 IC50=263μmol/L）目前已知抑制剂种类结构如下图:
结构 | IC50[μM] | |
1 |
| 22 |
2 |
| 33 |
3 |
| 75 |
4 |
| 20 |
5 |
| 80 |
6 |
| 16 |
7 |
| mPGES-1 IC50=1.3μmol/L;5-LOXIC50=1.0μmol/L |
8 |
| mPGES-1 IC50=0.016μmol/L;COX-1IC50=118μmol/L，COX-2 IC50=263μmol/L |
前景：
由于mPGES-1在炎症的病理生理中发挥的重要作用,其有可能成为一个前景良好的药物靶点来开发预防或治疗关节炎及有关疾病的药物。通过构建基于mPGES-1、COX-1和COX-2基因调控或酶蛋白活性的药物筛选模型,从动植物、微生物来源物或合成化合物中筛选抑制mPGES-1表达或酶活性而较弱抑制或不抑制COX-1和COX-2的活性物质,进一步开发成新型抗炎药物,有望避开传统NSAIDs和特异性COX-2抑制剂的副作用。
文献目录
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3. 设计方案和技术路线
研究方案：由化合物1开环得到化合物2----脱水缩合引入氨基酸得到化合物3----经过闭环得到化合物4----最后在羧基上引入一个对溴笨胺得到化合物5----经过suzuki反应得到目标产物
研究方案：由化合物A开环得到化合物B---脱水缩合引入氨基酸得到化合物C---经过闭环得到化合物D----最后在羧基上引入一个对溴笨胺得到化合物E----经过suzuki反应得到目标产物
4. 工作计划
2022年2月8日-3月9日 查阅已有的mPGES-1抑制剂的研究进展方面文献，设计完成吡咯结构抑制剂或苯丙异喹啉结构抑制剂的合成路线
2022年3月10日-3月15日 准备阶段（查找购买所需要的试剂和反应装置）
5. 难点与创新点
由于mPGES-1在炎症的病理生理中发挥的重要作用,其有可能成为一个前景良好的药物靶点来开发预防或治疗关节炎及有关疾病的药物。
寻找抑制mPGES-1表达或酶活性而较弱抑制或不抑制COX-1和COX-2的活性物质,进一步开发成新型抗炎药物,有望避开传统NSAIDs和特异性COX-2抑制剂的副作用。
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