1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
大肠埃希菌是人类肠道的正常菌群之一，同时也是引起人类各种感染疾病的常见病原菌，可引起肠外感染，引起腹泻，新生儿败血症，伤口感染等疾病。在过去几十年里，临床分离的大肠埃希菌对抗生素的耐药性明显增强，耐药率在全世界各个国家和地区也有所不同。美国2012至2013年耐碳青霉烯类大肠埃希菌的检出率为1，且各个地区间差异较大。根据EARS-Net数据库，绝大多数欧洲国家从血培标本中分离的大肠埃希菌的耐碳青霉烯类抗生素耐药率为1[1]。按照致病作用将大肠杆菌分为六个种类，即能够致使胃肠道感染的肠道致病性的大肠杆菌（EPEC）、肠道产毒素性的大肠杆菌 (ETEC)、肠道侵袭性的大肠杆菌 (EIEC)、肠道出血性的大肠杆菌 (EHEC)、肠集聚性的大肠杆菌（EAEC）以及近年来发现的肠产志贺样毒素同时具有一定侵袭力的大肠杆菌（ESIES）。另外，还有能够致使尿道感染的尿道致病性的大肠杆菌 (UPEC)，以及最新命名的肠道集聚性的黏附大肠杆菌 （EAggEC）[2]。2014年中国 CHINET细菌耐药性监测结果显示，肠杆菌科细菌中大肠杆菌菌株的产超广谱β内酰胺酶检出率最高，检出率为55.8％。同时大肠杆菌对环丙沙星、庆大霉素、哌拉西林和磺胺的耐药率均接近或高于50％，与往年相近，对3种碳青霉烯类的耐药率仍然较低[3]。高明祥[4]等研究发现大肠杆菌超广谱β内酰胺酶阳性发生率达75.1％，所以研究大肠杆菌感染现状，对控制耐药菌株的蔓延及临床合理用药具有十分重要的意义。
碳青霉素类抗生素是1970年以后根据沙纳霉素又称硫霉素研制的一种新类型的β内酰胺类抗生素[5-6]。碳青霉烯类抗生素的结构与青霉素类的青霉环比较相似，但两者也有不同之处，不同之处在于青霉素噻唑环上的硫原子被碳原子所替代，并且碳青霉烯类抗生素的C2与C3之间存在不饱和双键。大肠杆菌对碳青霉素类抗生素的耐药机制有：1产碳青霉酶。2药物结合蛋白发生改变。3细菌外穿孔蛋白质的消失和过度表达的主动外部排斥系统。有研究发现[7]，目前，肠杆菌科对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因就是由于携带KPC基因的质粒导致的。根据中国耐药监测网2005-2017年的大数据分析[8]，大肠杆菌对碳青霉烯类药物的耐药率在0.2-2.2之间。碳青霉素酶的生产是大肠杆菌抗碳青霉素抗生素的主要来源,其中最常见的是产生NDM酶的大肠杆菌。自2009年在克雷伯氏菌中首次发现新德里金属β内酰胺酶-1(NDM-1)以来，携带blaNDM的细菌逐渐在世界各地被发现[9-10]。到目前为止,已经发现了29种blaNDM变体。目前有研究[11]表明可以用三种方法来减缓对碳青素类抗生素的抗药性。1加强加快新型碳青霉烯类抗生素的研发工作。2制定合理的给药方案。3加强抗菌药的管理,延缓细菌的耐药性发展。
故本项目以江苏省常州市某畜禽屠宰场分离出的大肠杆菌为研究对象，开展大肠杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药性调查和耐药机制研究。主要开展内容为：分离纯化从江苏省常州市某畜禽屠宰场分离出的细菌，通过药敏试验检测分离出的大肠杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性，并采用PCR方法检测相应的耐药基因。由此调查革兰阴性菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及耐药基因的携带情况，为耐药性监测和风险评估提供参考。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
采用PCR、MLST、测序分析、药敏试验等方法调查革兰氏阴性菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及耐药基因的携带情况。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法和技术路线
1.1细菌分离纯化
在无菌实验操作台中使用一次性无菌接种环蘸取适量鸡盲肠内容物，分别在添加了万古霉素（30μg/mL）和美罗培南（0.5μg/mL）的麦康凯培养基上划线接种并且进行标记。接种后将麦康凯培养基放置在恒温培养箱中37℃培养18h。然后使用一次性无菌接种环从长出菌落的培养基上挑取单菌落，接种于1mL BHI培养基中，将培养基放置在恒温摇床中37℃培养过夜。最后用一次性无菌接种环挑出疑似菌落备用。
4. 研究创新点
特色或创新之处
在过去的几十年，抗生素广泛用于各种感染性疾病的治疗，但也正是由于抗生素的广泛使用，出现了越来越多的耐药基因。而碳青霉烯类曾被认为是抗多重耐药革兰阴性菌感染的最后防线，故研究革兰氏阴性菌对碳青霉烯类抗生素耐药的原因十分重要。碳青霉烯酶是革兰阴性杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。革兰阴性菌种类繁多，可通过质粒介导在细菌间互相传播，同时新的变体的出现导致细菌的耐药率逐年升高。本项目以此为切入点，首先拟从江苏省常州市某畜禽屠宰场临床分离大肠杆菌，检测大肠杆菌的耐药表型及相关耐药基因，进行药敏试验，测定抗菌药物对大肠杆菌的MIC值。分析大肠杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及耐药基因的携带情况，为耐药性监测和风险评估提供参考。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2020.2-2020.4：查找相关文献，学习相关试验技能，制定试验计划。
2020.4-2020.5：进行实验。
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