兔出血症病毒变异毒株VP60基因特异性噬菌体肽库的构建开题报告

 2023-02-15 10:18:15

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一．国内外研究概况

兔出血症（Rabbit haemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种以急性肝坏死为主要特征的烈性传染病。该病传染性强、死亡率高。1984年2月，首先在我国爆发[1]，随后朝鲜、韩国、意大利、德国、印度等国家和地区也相继有该病的报道，目前在世界各国均有流行，并对养兔业造成巨大的经济损失[2-8]，同时严重威胁濒临灭绝的野兔品种。世界动物卫生组织（OIE）将其列为国际动物保健编目B类疫病，我国将其列为二类疫病。

2010年，G.Le-Recule等在法国兔场发现了一株非典型兔瘟，命名为RHDVb或RHDV2，该变异毒株与经典的G1-G6型在遗传特性上有很大的差异，免疫经典毒株RHDV的疫苗对RHDV2的感染不能产生很好的交叉免疫保护作用，导致该毒株在家养和野生的兔子中迅速传播[9]。RHDV2自2010年首次在法国被报道以来，迅速从欧洲大陆传播开来，流行趋势在世界范围内逐步扩大。RHDV2不仅传播速度快、潜伏期长，而且感染宿主的范围较经典毒株更广，因此该毒株一旦流行，将对养兔业产生十分严重的危害甚至可造成毁灭性的打击。虽然迄今为止在中国还未有检测到该毒株的报道，但是随时面临发生该疫情的风险，我们应该加强对变异毒株RHDV2的认识，建立快速、特异、灵敏的RHDV2诊断方法。

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2. 研究的基本内容和问题

一．研究目标

本研究旨在构建符合要求的兔出血症病毒新毒株VP60基因特异性噬菌体展示肽库。

二．研究内容和拟解决的关键问题

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3. 研究的方法与方案

一．研究方法

利用DNaseⅠ随机消化法构建VP60基因噬菌体随机肽库。采用生物淘选和噬菌体原位杂交技术，选用1B8、1D4、5H3和A3C4株纯化的单克隆抗体对该肽库进行抗原表位的鉴定。

二．实验方案

1.以质粒pMD19-T-VP60为模板PCR扩增VP60基因，琼脂糖凝胶电泳检测VP60扩增效果，扩增产物回收及测序。

2.经测序正确的VP60 基因随机消化，超滤后合适大小的酶切片段经补平、去磷酸化、加接头、加接头片段酶切后与去磷酸化的噬菌粒PC89连接。

PC89噬菌粒通过对培养携带PC89的大肠杆菌提取质粒获得，后经pEcoRⅠ酶切、去磷酸化处理制得上述去磷酸化的噬菌粒PC89。

3.重组质粒经电转化转入感受态大肠杆菌XL1-blue后，通过辅助噬菌体VCSM13的侵染，培养沉淀噬菌体后即为噬菌体展示的VP60基因特异性肽库。

4.最后测定VP60基因特异性噬菌体展示肽库滴度以及鉴定随机性，评判构建结果。

三．技术路线

质粒pMD19-T-VP60由江苏省农业科学院兽医研究所兔病组构建并保存

以上述质粒为模板PCR扩增VP60基因

利用DNaseⅠ随机消化法构建VP60基因噬菌体随机肽库

检测所构建肽库特异性和丰富性，评价构建结果

四．可行性分析

所用实验方案参照课题组兔出血症病毒RHDV VP60基因特异性噬菌体展示肽库的构建，该实验已经成功完成故能得到相应技术支持。

4. 研究创新点

目前，尚没有关于兔出血症病毒噬菌体展示肽库的报道，因此，构建高通量的噬菌体展示肽库显得尤为重要。为进一步筛选和丰富VP60抗原表位奠定基础，还可用于VP60与受体结合域的鉴定，对阐述RHDV2的感染、致病和免疫保护机制具有重要意义，同时为抗病毒药物的研究奠定基础。近年来RHDV2取代经典RHDV的趋势正在逐步扩大。虽然迄今为止在中国还未有检测到该毒株的报道，但是随时面临发生该疫情的风险。因此，我们应该加强对变异毒株RHDV2的认识，把握国内流行情况，提前做好防范措施。

5. 研究计划与进展

2016.9-2016.10 查阅资料，学习相关实验技术

2016.11-2016.12 扩增VP60基因、测序、消化条件优化以及噬菌粒载体的制备

2016.12-2017.1 完成随机片段与载体的连接及肽库的构建，结果检测

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