猪萨佩罗病毒 RT-PCR 检测方法的建立与应用及基因组序列测定与分析开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

意义：

猪萨佩罗病毒(Pcine Sapelovirus, PSV) 临床上可以造成包括猪的脑脊髓灰质炎、肠道炎、肺部炎症、生殖器官疾病等多众疾病在内的多系统综合征，于上世纪由英国科学家分离自腹泻猪的粪便样本，随后在中国、巴西、西班牙、英国、韩国等其它国家相继发现并报道。根据目前的调查可知，萨佩罗病毒属分为禽萨佩罗病毒(之前被称为鸭小RNA病毒TW90A)、萨佩罗病毒A (PSV-1)和萨佩罗病毒B (之前被称为猿萨佩罗病毒)[1]，而我们实验室所检测的猪萨佩罗病毒是归属于萨佩罗病毒A 的。我国的第一例猪萨佩罗病毒是由LAN等在某爆发猪脑脊髓炎的猪场首次分离并测序的。分析随后的流行病学调查我们可以看到：猪萨佩罗病毒在我国猪群中是广泛存在的而且具有一定的感染率。尽管在人类中还未检测到萨佩罗病毒目前，但在猪、鸟类、灵长类动物、海狮以及老鼠中已经发现了该病毒的存在。根据在华东、华南、西南等地区的猪场开展的流行病学调查，我们可以看到猪萨佩罗病毒在我国的猪场中有一定的阳性率。其中，华东地区猪萨佩罗病毒的阳性率为17.2，华南地区的检出率为18.21，四川地区较高，达到20.4[2]。

根据文献总结分析，当前关于猪萨佩罗病毒的研究还主要集中在其流行病学调查及分析。迄今为止，国内外尚未见关于猪萨佩罗病毒入侵方式与途径、感染宿主范围、病毒的变异与迁移、免疫与致病、细胞和组织嗜性、暴发与流行、跨种间感染与传播等机制的研究报道[3]。尽管关于猪萨佩罗病毒的识别位点已有初步研究，但关于猪萨佩罗病毒的受体的特异性进化以及对其致病性和基因靶向性的影响，还有猪萨佩罗病毒急性感染时的暴发流行、隐性感染时的亚临床症状等相关致病机理研究在国内外还仍未开展和深入。因此，能够准确检测实验室分离得到的PSV全序列将会为萨佩罗病毒的进一步研究提非常重要的基础。此外，灵长类猿源萨佩罗病毒[4]的报道引发了猪萨佩罗病毒是否存在潜在跨种间传播感染的可能性的讨论，这亟待我们通过进一步深入分析中国地区的猪萨佩罗病毒与其他类型的萨佩罗病毒（如禽萨佩罗病毒）的亲缘关系。

国内外研究概况：

根据文献调查，来自中国很多猪场的分子流行病学调查显示，PSV在中国猪群中有较高感染率。病毒进入机体后，常与各种各样的病原伴随感染造成病猪临床症状复杂多样，诊断和综合防控难度加大^[5]，有时会造成养猪场毁灭性打击，成为养猪业近年来出现的新问题。目前，对于PSV感染尚且没有安全有效的临床治疗方法和预防疫苗，因此，做好病原预防工作和采用快速方便有效的诊断方法就显得尤为重要^[6]。

应用前景：

1.目前对于猪萨佩罗病毒的临床检测并没有绝对有效安全的检测手段，本实验将摸索一种快捷有效安全的RT-PCR检测手段^[7]。

2.对我国范围的猪场的PCV感染情况进行调查，为PCV的流行病学调查提供了基础^[8]。

3.分析萨佩罗病毒的同源性与进化树，考虑其突变的可能性^[9]。

主要参考文献：

[1] 逄凤娇,俞正玉,何孔旺,等. 猪Deltaconavirus RT- PCR 检测方法的建立及其应用[J]. 中国预防兽医学报,2015(37)683-686.

[2] 范忠良,林宝山等. 猪萨佩罗病毒在四川地区猪群中的感染调查[J].四川畜牧兽医,2015,6(5)29-30.

[3] 陈俊伟,张祥斌,张云静,等. 猪萨佩罗病毒YC2011株1D基因的克隆及原核表达[J]. 动物医学进展,2014,35(1)68-72.

[4] Lan D, Ji W, Yang S, et al. Isolation acterization of the first Chinese pcine sapelovirus strain [J]. Archives of Virology, 2011, 156(9) 1567-1574.

[5] Lamont P, Betts A. Studies on enteroviruses of the pig IV. The isolation in tissue culture of a possible enteric cytopathogenic swine phan (ECSO) virus (V13) the faeces of a pig [J]. Research in Veterinary Science, 1960, 1 152-159.

[6] Cano-Gmez C, Garca-Casado M A, Siguer R, et al. Teschoviruses sapeloviruses in faecal samples wild boar in Spain [J]. Veterinary Microbiology, 2013, 165(1) 115-122.

[7] Schock A, Gurrala R, Fuller H, et al. Investigation into an outbreak of encephalomyelitis caused by a neuroinvasive pcine sapelovirus in the United Kingdom [J]. Veterinary Microbiology, 2014, 172(3) 381-389.

[8] 兰道亮,吉文汇,王长松,等．华东部分地区猪群中猪萨佩罗病毒分子流行病学调查[J]．动物医学进展,2012,33(12)116-121.

[9] 毕胜利,曲萌,陈廷友,等．科萨奇B3病毒VP1基因在原核中的表达及临床意义[J]．中国免疫学杂志,2007,23847-850.

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

研究方法：RT-PCR方法、基因测序、同源性分析、动物实验

实验方案：

.引物的设计与合成

根据已有的猪萨佩罗病毒的基因序列，利用DNAStar 和Primer5.0软件设计扩增的特异性上下游引物。

2.病料样品的处理及模板的制备

将感染不同病原的临床组织病料样品加入PBS 缓冲液进行充分的研磨并反复冻融（3次），离心后取上清液弃去下层沉淀，提取病毒总RNA，并制备cDNA。

1. RT- PCR 检测方法的优化

程序：预变性94℃5min使platinum taq恢复活性，94℃ 30s，扩增的退火温度分别采用53 ℃、54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃进行扩增，72℃ 30s，扩增35个循环后72℃延伸10min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测并紫外照射观察结果。

2. 特异性试验

参照核酸提取试剂盒说明书方法提取TGEV，PRV，PRRSV，PCV，PEDV，CSFV和PSV的核酸， 以TGEV，PRV，PRRSV，PCV，PEDV，CSFV和PSV反转录制备的cDNA 为模板。利用建立并优化后的RT-PCR 方法对这几种病原进行扩增，增加阴性对照，检测该PCR检测方法的特异性。

3. 敏感性试验

对重组后的质粒浓度进行测定并计算拷贝数，然后稀释10 倍系列后，将不同的浓度作为模板，用前面得到的最佳RT-PCR 检测方法扩增，观察该PCR条件的敏感性是否合格。

4. RT- PCR 方法的可靠性检测

将5份临床样品扩增为PSV 阳性的PCR 产物克隆至pMD19-T 载体中，对重组质粒接种至大肠杆菌DH5α，摇菌后送往公司测序，根据结果判断该PCR 方法的可靠性。

5. 临床样品检测

提取2014 到2016 年间以江苏省为中心的几个省份采集的345 份病料样品cDNA，利用本研究建立并优化得到的RT-PCR 方法进行检测，以本实验室分离得到的PSV提取的cDNA作为阳性对照。

6. Sapelovirus cDNA全长测序及分析

根据PubMed中已有的PSV 的基因序列，将cDNA全长分为六段分别测序，利用DNAStar 和Primer5.0软件设计每一段扩增的特异性引物。

以实验室得到的猪萨佩罗病毒cDNA为模板，利用引物一到引物六进行PCR 扩增。取 PCR 产物在1的琼脂糖凝胶上电泳，用紫外光照射并观察，对扩增产物进行验证。如果扩增条带与引物所切割的目的片段的bp数一致，则进行切胶，用胶回收试剂盒对切胶产物进行回收纯化后，将目的基因克隆于pMD 19-T 载体，重复多次扩增克隆，并将所有的克隆产物都送往公司进行测序。测序的结果通过DNAStar 进行编辑，并且通过PubMed的BLAST 进行一一比对，确定为PSV 的片段后，用DNAStar 软件将得到的PSV 片段序列拼接成全序列基因并和来自NCBI数据库中的参考株基因进行比对及编辑。选取几个有代表性的毒株序列，利用MEGA构建系统发育进化树并分析它们的同源性。

可行性分析：

1.PEDV完整序列已公布，便于分析并选取拟表达序列。

2.本实验室已经成功构建了PEDV的感染性克隆方法。

3.本实验室对PEDV有较深入的研究，具备较成熟的相关研究技术。

可行性分析：

1.PSV完整序列已公布，便于分析并选取上下游引物。

2.本实验室已经已有PSV、PCV等病毒分离。

3.本实验室对PSV有较深入的研究，具备较成熟的相关研究技术。