1. 研究目的与意义
内容：通过整体及离体实验，参照功能性食品申报要求中免疫调节功能要求，初步观察乳铁蛋白免疫调节相关效应。本实验拟建立环磷酰胺致小鼠免疫低下模型，给重组乳铁蛋白后观察药物对免疫力低下小鼠1通过抗体生成细胞检测，血清溶血素测定，计算半数溶血值，空斑数量从而观察药物对B细胞的影响；2通过二硝基氟苯诱导免疫低下小鼠DTH实验，测定耳厚、胸腺脾脏系数、从而进行T细胞免疫功能的评价。
意义：乳铁蛋白具有多种生理性能，可用于机体的免疫调节以及抗菌抗病毒，抗氧化，抗癌，促进胃肠道铁吸收作用。乳铁蛋白的免疫调节功能是其中最为主要的功能之一，本课题拟通过对小鼠T、B细胞免疫功能进行评价，探讨重组人乳铁蛋白在免疫调节方面的作用，进一步验证重组人乳铁蛋白的免疫调节作用，为临床靶向人乳铁蛋白进行免疫治疗提供参考。
2. 文献综述
人乳铁蛋白免疫调节作用研究进展
韦恩安 047112202
摘 要：乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf）是哺乳动物乳清中与铁具有高度亲和力的一类球蛋白。研究发现，乳铁蛋白具有抗菌、抗病毒、抗氧化和促进胃肠道铁吸收等多种生理功能。进一步研究表明，乳铁蛋白可以下调炎性因子与促炎因子的释放,促进T细胞、B细胞、巨噬细胞的成熟与活化,与受体结合抑制炎性反应,募集免疫细胞、激活NK细胞,进而发挥免疫调节作用。本文对近年来乳铁蛋白的免疫调节作用研究进展进行综述，并探讨乳铁蛋白在肿瘤及变应性鼻炎中的作用，为临床靶向乳铁蛋白进行及病的治疗和后续研究提供重要参考。
3. 设计方案和技术路线
1针对体液免疫方面的免疫调节功能性评价：
1抗体生成细胞检测：采用溶血空斑试验法，用绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使抗体分泌细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。建立环磷酰胺致小鼠免疫低下模型，并同时给药27天，每鼠腹腔注射2%压积SRBC 0.2 ml致敏。4天后，小鼠脱颈椎处死，取出脾脏，制成单细胞悬液，进行溶血空斑实验，计数溶血空斑数，用空斑数/106脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。
2血清溶血素测定：采用半数溶血值（HC50）法测定。建立环磷酰胺致小鼠免疫低下模型，并同时给药27天，每鼠腹腔注射2%压积SRBC 0.2 ml致敏。4天后，小鼠摘眼球采血，取血清测溶血反应，另设不加血清以（SA缓冲液代替）的对照管为比色空白。于540nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。
溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，按下列公式计算：
样品光密度值
样品HC50＝---------------------------------稀释倍数
SRBC半数溶血时的光密度值
2针对整体细胞免疫功能方面的免疫调节功能性评价：
二硝基氟苯诱导免疫低下小鼠DTH实验：小鼠连续灌胃25天及26天腹腔注射40 mg/kg环磷酰胺，之后腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3 cm3 cm、用1% DNFB溶液50 μl均匀涂抹致敏。致敏后继续给药5天，用DNFB溶液10 μl均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8 mm的耳片，称重。左右耳片重量差为肿胀度，同时取小鼠的胸腺及脾脏称重，计算胸腺及脾脏系数。
重组乳铁蛋白免疫调节方案实验 |
抗体生成检测 |
DNFB诱导免疫低下小鼠DTH实验 |
小鼠适应性饲养、给药、造模、致敏 |
眼眶取血 |
取脾脏 |
血清溶血素实验 |
溶血空斑实验 |
测OD值 计算半数溶血值 |
悬液的制备、灌注小室 观察计数透明空斑 |
小鼠适应性饲养、给药、造模、致敏 |
取左右耳耳片 |
取胸腺、脾脏称重 |
称重、 测量耳肿胀 |
称重 计算脾脏 胸腺系数 |
判断乳铁蛋白免疫调节功能的显著性 |
4. 工作计划
3.4 环磷酰胺模型预实验(已完成)
3.17-4.14 整体细胞免疫功能：二硝基氟苯诱导免疫低下小鼠DTH实验。
5. 难点与创新点
本课题拟通过对小鼠T、B细胞免疫功能进行评价，探讨重组人乳铁蛋白在免疫调节方面的作用，进一步验证重组人乳铁蛋白的免疫调节作用，为临床靶向人乳铁蛋白进行免疫治疗提供参考。
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