1. 研究目的与意义
休眠肿瘤可能存在于癌症的原位或转移灶内，也可以良性结节的形式存在。良性结节在人体器官内大量存在。以乳腺癌为例，在 40-50岁女性中，超过四分之一的女性在乳腺中存在原位良性结节。然而在此年龄区间内，只有不足 1% 的女性被诊断出患有乳腺癌。从这个数据的对比，可以看出:并非所有的原位 乳腺肿瘤都能发展成癌症。究竟是什么机制唤醒休眠肿瘤?这个问题的解决将有助于肿瘤预防及治疗。
血管生成开关，是指肿瘤获得促进血管生成的能力，在组织内部形成高密度血管网络，将肿瘤与宿主循环系统联系起来的过程，是肿瘤从周围环境获取物质能量基础，实现从单个肿瘤细胞扩增至可侵袭、转移致死的恶性肿瘤的必要条件。血管生成开关的打开是肿瘤细胞从平衡态向促血管生成态转变的过程， 是休眠肿瘤向侵袭转移发展的关键环节
血管生成开关的打开属于离散事件，可以受多细胞、多因子调节，出现在肿瘤发生、发展、恶化及转移的任意阶段。它不仅仅是肿瘤细胞自身发生基因突变而引发的永久性的遗传事件，亦可以是肿瘤细胞受微环境影响而产生的瞬时改变。
2. 文献综述
血管内皮生长因子对肿瘤转移机制的关系问题文献综述
摘要：肿瘤目前是致死率最高的人类疾病之一。血管新生是肿瘤的重要特征之一。肿瘤血管新生受多分子、多因素调控，其中血管内皮生长因子（VEGF）是极为重要的生物调控分子。国内学者对VEGF血管内皮生长因子在眼科疾病以及白血病方面的问题研究以及应用进行了大量研究，取得了重大成果。因此探究VEGF与肿瘤转移机制的关系问题也成为热点。 为了全面了解这一问题，本综述主要通过查询CNKI 中国期刊全文数据库，以核心期刊为范围，以VEGF、肿瘤转移为关键词进行搜索，收集了近5年文献19篇，并对于VEGF的家族成员、生物学功能、以及与肿瘤转移机制的关系研究进展作一综述。目的是阐明VEGF与肿瘤转移机制的重要意义，为接下来的研究提供帮助。
关键词：VEGF ；Avastin（Bevacizumab，贝伐珠单抗） ；血管生成；肿瘤转移
A literature review of the relationship between vascular endothelial growth factor and tumor metastasis
Abstracthis: This article focuses on the relationship between VEGF vascular endothelial growth factor and tumor metastasis. Domestic scholars have done a lot of research on the research and application of VEGF vascular endothelial growth factor in ophthalmological diseases and leukemia, and have achieved significant results. This article reviews the mechanisms of VEGF vascular endothelial growth factor family and receptors, tumor metastasis, and the relationship between VEGF vascular endothelial growth factor and tumor metastasis. This article, combined with a recent published study, aims to elucidate the importance of VEGF vascular endothelial growth factor and tumor metastasis mechanisms, and to assist in the next study.
Key Words:VEGF; Avastin (Bevacizumab, bevacizumab); Angiogenesis; Tumor Metastasis
血管发生是从现有血管网络基础上生成新的血管，这一过程受到严格的调控。正常的生理过程（如胚胎发育、伤口愈合、月经周期、心肌继发血管形成等）中，血管发受到内源性激活剂和抑制剂的调控。在成年动物中，内源性调节剂处在平衡状态，大部分的内皮细胞处于静息状态。在病理过程（如生长与转移等）中，血管发生的调控处于失衡状态，即内源性的激活剂数目上胜于内源性的抑制剂，从而刺激血管发生，而且病理状态下新形的血管大多结构不完全、排列紊乱的，导致血流的无序和血管的渗漏【1】。病理性血管生成几乎全部发生在局部缺血性、炎症性或肿瘤性疾病中，这些疾病的发病机制中，血管发生扮演着重要的角色，常被称为血管生成性疾病【2】。因此病理性血管生成与肿瘤的发生有着密不可分的关系。而肿瘤微环境在肿瘤的起源、生长和转移中发挥着重要的作用。在肿瘤发生发展的过程中，肿瘤的生长速度超过血管的供给能力，使肿瘤处于缺氧的环境中，缺氧触发α系统，使得促血管因子的产生超过抑血管因子的产生，这就是所谓的血管生成转换，导致病理性血管生成【3】。所以说VEGF血管内皮生长因子与肿瘤的血管生成就会有着重要的关联。
1971 年，Folkman发现血管生成在肿瘤生成中发挥重要的作用，并提出假设：阻止血管发生可能会成为治疗肿瘤和其他疾病的对策[4]。在40几年后，他的假设得到了证明， Avastin作为美国FDA批准的第一个抗肿瘤血管生成药物，通过持续抑制肿瘤血管的生成，阻断肿瘤生长所需的血液、氧气和其它营养，这实现断供的目的【5】。相关研究表示：肿瘤在生长过程中，会有很多新生血管生成，进而出现肿瘤转移，引起患者病情恶化【6】。
通过抑制肿瘤血管生成的治疗癌症的猜想由美国外科医生Dr. Judah Folkman于1971年提出，但到了1989年才由Nopoleone Ferrara 和by Jean Plouet发现了VEGF，VEHF的发现促进了肿瘤血管生成的研究，也为单克隆抗体药物Avastin的研发提供了理论依据。
一、关于VEGF研究的重大里程事件
时间（年） | 事件 | 参考文献 |
1971 | 美国外科医生Dr. Judah Folkman 提出假设：肿瘤生长依赖血管生成过程。这个猜想于《新英格兰医学杂志》刊登后，他被当时主流的医生和科学家视为异类。 | [5] |
1983 | Dr.Harold Dvorak 发现血管通透性因子（VPF） | |
1984 | 美国哈佛大学医学院的Yuen shing和Michael Klagsbrun纯化首个血管生成因子-碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | |
1989 | 最重要的血管生成因子-VEGF被Nopoleone Ferrara 和by Jean Plouet 发现。最后人们证实VEGF就是1983年Harold发现的VPF | |
1999 | 46种用于治疗癌症的抗血管生成药物进入临床 | |
2003 | 单克隆抗体药物Avastin用于抑制肿瘤血管生成。 | |
2008 | 单克隆抗体药物Avastin成为了获得批准用于治疗乳腺癌的第一个抗血管药物。 |
二、VEGF的家族及受体
VEGF -A通常被称为VEGF，因为VEGF -A是血管发生和祖内皮细胞分化的关键调节剂。由于mRNA的不同剪接，VEGF -A拥有四个亚型：VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206，天然VEGF165是一种肝素结合糖蛋白，分子量物45kDa，在四种亚型中VEGF165无论在数量还是在生物活性上都是占主导地位，在人类多种肿瘤中，VEGF165都是过表达的，而且这种过表达与肿瘤的增殖、侵袭和转移呈正相关。VEGF -B和PGF也可以刺激正常组织的血管发生，作用比VEGF -A弱，而PGF增加能刺激肿瘤和炎性病变中的病理性血管形成。VEGF -C和VEGF -D主要参与淋巴管生成的调节。
1家族
类别 | 作用 | 参考文献 |
VEGF -A | 促进新生血管形成和使血管通透性增加 | [19] |
VEGF -B | 在非新生血管形成的肿瘤中起作用 | |
VEGF -C | 在癌组织的新生血管和新生淋巴管的形成过程中起作用 | |
VEGF -D | 在癌组织的新生血管和新生淋巴管的形成过程中起作用 | |
VEGF -E | 一种潜在的新生血管形成因 | |
胎盘生长因子（PGF） | 促进新生血管形成，使血管通透性增加，在实验性脉络膜新生血管中PGF的表达明显增高 |
2受体
分类 | 分布 | 作用 | 参考文献 |
VEGFR-1 | 肿瘤血管内皮表面 | 调节肿瘤血管的生成 | [19] |
VEGFR-2 | 肿瘤血管内皮表面 | 调节肿瘤血管的生成 | |
VEGFR-3 | 淋巴内皮表面 | 调节肿瘤淋巴管的生成 |
VEGFR-1促进内皮细胞增殖、趋化单核细胞和巨噬细胞、募集骨髓源性内皮与造血前体细胞。VEGFR-1在胚胎发育过程中负调控生理性血管发生。尽管VEGFR-1与VEGF亲和力比VEGFR-2高10倍，但VEGFR-2被认为是血管内皮细胞与VEGF反应的主要负责受体。VEGFR-2活化可刺激内皮细胞生长、迁移和管状形成，并能提高血管的通透性。
三、肿瘤转移机制的研究
现在研究肿瘤转移机制主要分为四种，第一种被称为种子与土壤学说，第二种称为肿瘤干细胞转移，第三种是上皮 －间质转化，最后一种是肿瘤休眠。第一种学说中的种子指的是肿瘤细胞，而土壤则指的是肿瘤所处的微环境。有研究表明：缺氧微环境是实体肿瘤的重要特征。在缺氧条件下,肿瘤细胞会分泌多种血管生长因子以促进异常血管的形成。同时为了寻找更佳适宜的土壤,肿瘤细胞的侵袭与转移能力也会得到进一步的提高。此外,缺氧微环境对肿瘤细胞具有筛选作用,使肿瘤的恶性程度进一步提高,导致肿瘤细胞对化疗药物或放射治疗不敏感。由此可见,缺氧微环境是肿瘤的不良预后的重要因素【7】。VEGF血管内皮生长因子的生物学主要功能便是在低氧环境下，VEGF通过提高血浆酶原活化因子（PA）和血浆酶原活化因子抑制因子-l（PAI-1）的mRNA表达，来提高血浆酶原活化因子的活性，促进细胞外蛋白水解，进而促进新生毛细血管的形成。由此可见，VEGF血管内皮生长因子与肿瘤的转移可能有一定的的关系。第二种的肿瘤干细胞指的是肿瘤转移中的成功形成新病灶的肿瘤细胞，因为转移的肿瘤很多，但能成功的很少，所以研究针对肿瘤干细胞的药物就能有效治疗肿瘤。但由于肿瘤干细胞尚未分化，缺少抗原标志，尚需进一步的研究。上皮 － 间质转化 (epithelial-mesenchymal transi-tion，EMT) 是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，在胚胎发育、组织重建和肿瘤转移等多种疾病中发挥着重要的作用【8】。EMT 是上皮细胞来源恶性肿瘤获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。EMT过程是细胞去分化的过程，经历 EMT 的肿瘤细胞在一定程度上具有类似干细胞的性质 【9】。抑制EMT过程有利于控制肿瘤的转移，起到治疗的效果。肿瘤细胞离开原发灶到达转移靶器官后定居后可继续生长，短期内形成新的肿瘤灶。但并不是所有的具有形成转移能力的肿瘤细胞到达转移靶器官后就立即开始进入增殖的细胞周期，而是部分作为静息期的细胞定居下来，在相当长的时间内处于稳定状态而不会形成新的转移灶，即肿瘤细胞休眠【10】。由于在切除靶器官后，肿瘤细胞仍然能从休眠中苏醒，这也就是乳腺癌在术后仍然会致死的原因之一。
从以上四种肿瘤转移机制方式的研究来看，研究阻断EMT通路以及控制肿瘤微环境比较容易，而研究肿瘤干细胞和肿瘤休眠就比较困难。所以说研究肿瘤微环境的影响因素的文章就比较的多，本文就对于最新的有关VEGF血管内皮生长因子与肿瘤的转移机制的研究进展进行综述。
四、VEGF血管内皮生长因子与肿瘤的转移机制的研究
近年来关于VEGF血管内皮生长因子与肿瘤的转移机制的研究文章还是很多的，其中Maniotis 等【11】对人眼葡萄膜黑色素瘤进行了深入的研究，首先明确提出了肿瘤细胞自身能形成血管管道为肿瘤提供血供。Maniotis的发现为治疗肿瘤提供了新的方法，可以通过切断肿瘤的血供的方式，达到消灭肿瘤的目的。在之后的研究中，研究人员发现了肿瘤中有一种基因叫肿瘤转移相关基因1（MTA1），它在胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤疾病中一般均呈现高表达 [12]，并且郭玲等【13】证明血管内皮生长因子与肿瘤转移相关基因1（MTA1）有关，二者呈协同作用。这也证明血管内皮生长因子与肿瘤的转移有关。还有一篇文章是讨论的是缺氧诱因子１α与血管内皮生长因子及CXCR4受体在甲状腺乳头状癌（PTC）中的表达及与肿瘤转移的关系，他们发现HIF-1α、VEGF及CXCR4同时高表达的患者肿瘤转移率要显著高于单因子高表达的PTC患者,表明这三者之间对于肿瘤的转移有可能存在着信号通路，可以控制肿瘤的转移【14】。Guan【15】等发现在缺氧的环境下肿瘤就会激活HIF-1α的表达，并通过HIF-1α/CXCR4通路促进骨肉瘤的转移。而Zhang【16】等发现认为CXCR4介导的骨肉瘤生长和肺转移过程中，间充质干细胞高表达起到了明显的促进作用。因此冉程【17】等认为HIF-1α、VEGF及CXCR4三者在肿瘤转移过程中共同发挥了重要作用，可以促进肿瘤的生长并增加肿瘤的转移能力。
从左图可以看出在缺氧环境下HIF-1α激活VEGF基因产生VEGF以及VEGFR，之后通过Raf/Mek/Erk通路引起血管新生（angiogenesis）和血管形成（vasculogenesis）。Ras/Raf/MEK/ERK信号级联通路，这是一条有丝分裂原活白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路，Ras基因激活后的下游信号通路。它将细胞外信号传递到细胞核内，引起细胞内特异蛋白的表谱变化，引起血管新生和血管形成。现在有Bevacizumab（贝伐珠单抗）这个药物来抑制肿瘤的血管生成，从而达到杀死肿瘤的目的。但是单一的靶点治疗效果差并且容易产生耐药性，更严重的是对于一些患者抗血管生成是无效的。所以现在的对于抗肿瘤血管的生成研究，开始转向多靶点共同抑制肿瘤血管生成。一项研究发现对纤维母细胞生长因子（FGF）和VEGF双重抑制剂 β２糖蛋白－１以剂量依赖性的方式抑制肿瘤增殖，迁移和血管形成。他们发现使用FGF和VEGF的双重抑制剂可以有效地抑制肿瘤转移，并对产生耐药性的患者仍然有效。另一项研究是从靶向淋巴管和血管， Sunitinib能够阻断VEGF受体2 ，而且还能阻断淋巴管相关的VEGF受体3【18】。这些研究都从多方面探究如何抗肿瘤血管生成，从而达到更有效的抗肿瘤转移以及抗耐药性。
五、靶向VEGF/VEGFR信号通路的肿瘤治疗策略
近年针对抑制VEGF来抑制肿瘤的转移的药物得到了迅速发展，其中Avastin于2004年2月26日获得FDA的批准上市，是美国第一个上市的抑制肿瘤血管生成的药。该药通过与 VEGF结合并阻断其生物活性，从而达到抗肿瘤的作用。临床研究表明贝伐单抗的血清清除率与患者的体重、性别和肿瘤负荷的不同而有所不同。然而对某些患者，抗血管生成治疗是无效的；有的起初有效，但很快产生耐受性。其中最主要的原因是针对肿瘤血管生成的信号通路较复杂，单一靶点治疗效果差，容易产生耐药性。尽管这样贝伐单抗在2018年也是全球销售额前五的药物，所以研制新的针对肿瘤血管生成的多靶点药物就极为重要。
六、总结
基于VEGF在肿瘤转移中的重要性，针对VEGF信号通路进行干预成为抗肿瘤转移药物研发的潜在方向。因此本人的毕业设计将建立一个检测VEGF信号通路激活的报告基因系统，为新药研究提供有效的细胞筛选模型。
参考文献
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3. 设计方案和技术路线
1．通过PCR技术构建CRISPR载体
(1)根据Ensemble数据库查找VEGF-A基因组序列，结合CRISPR/Cas9在线设计工具，设计相应的sgRNA序列，合成引物
(2)高温变性，低温退火，与载体连接
4. 工作计划
2.19 毕业论文选题
3.13 毕业论文开题报告
3.15-3.19细胞培养、质粒扩增
5. 难点与创新点
本实验旨在构建具有含有特异性强、灵敏度高报告基因的人源乳腺癌细胞株，可用于后期体内实时、定量检测肿瘤血管生成开关，对于筛选基于抗血管新生的肿瘤药物将提供有用的模式细胞株，有利于拓展现有实验技术平台。
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